四川盆地油用牡丹種子品質地區差異及其與生態因子的關系

孫志鵬，武華衛，方 穎，賴世會，羅建勛

(四川省林業科學研究院，成都 610081)

油用牡丹(PaeoniasufruticosaAndr．)是中國獨有的原生多年生小灌木，是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)牡丹組中結實能力強并能用來生產種籽、加工食用牡丹籽油的牡丹類型[1-3]。作為中國新興的油料作物，油用牡丹籽含油率在20%以上，不飽和脂肪酸含量高達92%以上(其中α-亞麻酸占42%)，多項指標超過被稱為“液體黃金”的橄欖油，經濟價值極高[4-5]。目前，油用牡丹主要以‘鳳丹’(Paeoniaostii)和‘紫斑牡丹’(P．rockii)兩大品種群為栽培材料[6]，其中‘鳳丹’是由楊山牡丹(PaeoniaostiaT. Hong et J. X. Zhang)經栽培演化形成的品種亞群，具耐濕熱、適生性強和結實率高等特點，兼具觀賞、藥用和油用價值[7-8]。近年來，因其含油量高、油質好等特點，全國范圍內‘鳳丹’被越來越多省份引種栽植。四川省自2011年開始引種，現主要分布于成都、綿陽、樂山、巴中、達州、遂寧、南充、巴中、涼山州布拖、鹽源以及阿壩州金川縣等地。

目前，四川‘鳳丹’產業發展還處于起步階段，理論及實踐經驗不足，尚未形成適宜四川地區氣候條件的系統栽培繁育技術體系；同時，受各種植區氣候和土壤環境等自然因素影響，‘鳳丹’種子營養成分含量差異較大。已有研究表明，環境生態因子對種子中營養成分的累積具有重要影響，適宜的生態環境條件有利于種子優良品質的形成[9-11]。目前，對于油用牡丹的研究多集中于育種栽培[12-13]、牡丹籽油的成分分析[14-15]及牡丹籽油的提取方法[16-17]等方面，關于不同生態環境下‘鳳丹’種子營養成分含量差異及其與生態因子的耦合關系尚缺乏深入系統探討。因此，研究‘鳳丹’種子中營養成分的累積與生態因子的關系對生產實踐具有重要指導意義。本研究以四川盆地引種的‘鳳丹’種子為試驗材料，進行表型性狀和營養成分對比分析，并基于氣象、土壤養分和海拔等生態因子，探討各營養成分與生態因子的相關性，揭示影響種子主要營養成分的關鍵因子，以期為四川‘鳳丹’科學栽培、高效生產和產業健康發展提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 采樣地概況

本次試驗種子采集于四川盆地內的12個‘鳳丹’種植基地，包括巴中地區(南江縣和恩陽區)、綿陽地區(梓潼縣和游仙區)、成都地區(大邑縣和崇州市)、樂山地區(峨邊縣和沐川縣)、達州地區(達川區和宣漢縣)以及遂寧地區(蓬溪縣)。用手持GPS測定樣地的經緯度和海拔，登錄中國氣象科學數據共享服務網查詢系統(http://data.cma.cn)，獲取平均降水量、日照時數、年均溫、1月均溫、7月均溫和年均相對濕度。各采樣地環境生態因子見表1。

1.2 試驗材料

2020年8月，分別在12個‘鳳丹’種植基地采集樣品。每個采樣地選擇生長良好、果實發育正常的植株，采用對角線法選取20株進行球果采集，球果取回后，在實驗室自然晾干，剝取種子，備用。采集‘鳳丹’球果的同時采集土壤樣品，在每個采樣地的東、西、南、北4個方位分別采集0～20 cm土層的土壤，用四分法縮分，去除雜質后，裝于自封袋中，帶回實驗室自然風干，備用。

表1 采樣地的立地氣候和土壤條件

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 種子表型性狀千粒重采用四分法，隨機選取100粒種子，用測量精度為0.01 g的電子天平稱量；種子橫徑為與種柄延伸方向垂直的最大測量值，種子縱徑為與種柄延伸方向一致的種子大小測量值，用測量精度均為0.01 mm的游標卡尺測定，并據此計算種形指數(種形指數=種子縱徑/種子橫徑)。

1.3.2 種子營養成分①采用索氏抽提法測定種仁中的含油量，按照GB/T 14488.1-2008[18]進行測定。

②采用半微量凱氏定氮法測定種仁中的蛋白質含量，按照GB/T 5009.5-2010進行測定[19]。

③采用GC-MS測定牡丹籽油中5種主要的脂肪酸(亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸)[20]相對含量，按照GB/T 17376-2008[21]和GB/T 17377-2008[22]測定。

1.3.3 土壤養分含量土壤pH用酸度計直接測定；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀法-外加熱法測定；土壤堿解氮含量用堿解擴散法測定；土壤有效磷含量用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀含量用中性乙酸銨浸提—原子吸收分光光度法測定[23-26]。

1.4 數據分析

采用SPSS19.0和Excel 2013軟件對數據進行統計分析，用單因素方差分析法檢測不同性狀在各引種地間的差異顯著性，采用Canoco5.0軟件中的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)方法分析‘鳳丹’種子營養成分含量與生態因子之間的相互關系。

2 結果與分析

2.1 各樣地‘鳳丹’種子表型性狀分析

表型性狀是評價種子的重要組成部分，對衡量種子品質的優劣具有重要指導意義[27]。表2顯示，4個‘鳳丹’種子表型性狀橫徑、縱徑、種形指數和千粒重在12個采樣地間差異均達到極顯著水平(P<0.01)。其中，12個‘鳳丹’采樣地種子平均橫徑為9.05 mm，變幅為7.98～10.63 mm，其中樂山市峨邊縣、綿陽市游仙區、成都市崇州市均大于10 mm，綿陽市梓潼縣、達州市達川區均小于8.0 mm；各采樣地種子平均縱徑為9.32 mm，變幅為7.75～10.86 mm，巴中市南江縣、達州市宣漢縣及南充市西充縣均大于10 mm，僅成都市大邑縣小于8 mm；各采樣地種子平均種形指數為1.06，變幅為0.80～1.32，南充市西充縣、達州市宣漢縣、巴中市恩陽區和達州市達川區均大于1.20，綿陽市游仙區、成都市大邑縣、成都市崇州市和樂山市峨邊縣均小于0.90；各采樣地種子平均千粒重為348.85 g，變幅為311.23～393.15 g，其中巴中市南江縣、成都市崇州市、樂山市峨邊縣及綿陽市游仙區均超過370 g，分別是最小的巴中市恩陽區的1.26、1.19、1.23和1.23倍。另外，多重比較結果顯示：4個種子表型性狀均在3個或3個以上的引種地存在顯著差異和極顯著差異，說明這些性狀在不同采樣地間的多樣性較高；不同采樣地的種子橫徑、縱徑大小變化沒有明顯的規律性，但種形指數卻表現出明顯的隨著經度的增加呈逐步增大的趨勢。通過對‘鳳丹’各表型性狀的變異系數分析可知(表2)，在‘鳳丹’4個表型性狀中，平均變異系數最大的為種形指數(17.50%)，其次為橫徑(11.39%)和縱徑(9.06%)，變異系數最小的為千粒重(8.08%)，表明千粒重的變異程度最小，而種形指數的變異程度最大。

2.2 各樣地‘鳳丹’種子營養成分分析

2.2.1 含油率和蛋白質含量由圖1可以看出，各采樣地‘鳳丹’種子含油率的平均值為24.07%，變化幅度為20.5%～26.9%，超過平均值的采樣地有巴中、達州和南充地區以及樂山市沐川縣，并以樂山市沐川縣、達州市宣漢縣和巴中市南江縣的含油率最高，處于26.0%～26.9%之間，而遂寧市蓬溪縣的含油率最低，僅為20.5%。各采樣地‘鳳丹’種子蛋白質含量的平均值為17.1%，變化幅度為15.6%～19.6%，其中綿陽市游仙區、巴中市南江縣和巴中市恩陽區的最高且均超過18%，分別為19.6%、18.3%和18.1%，而成都市大邑縣和遂寧市蓬溪縣的蛋白質含量最低，均小于16%；巴中、南充地區‘鳳丹’種子的蛋白質含量高低與其含油率表現相似，也均超過平均值，而成都地區種子蛋白質含量高低同其含油率具有相同的規律，也均低于平均值。

2.2.2 脂肪酸含量圖2顯示，‘鳳丹’種子中5種主要脂肪酸(α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸)含量以α-亞麻酸較高，遠高于其他成分，也遠高于在橄欖油中含量，因此，α-亞麻酸含量在一定程度上也決定了‘鳳丹’籽油的品質[28]。其中，不同采樣地‘鳳丹’籽油中α-亞麻酸含量存在顯著差異(P<0.05)，含量處于42.8%～47.1%之間，并以巴中市南江縣、綿陽市游仙區‘鳳丹’α-亞麻酸含量較高(>46%)，而以南充市西充縣、達州市達川區較低(<43%)；不同采樣地‘鳳丹’籽油中亞油酸含量也存在顯著差異(P<0.05)，含量處于15.7%～19.6%之間；不同采樣地‘鳳丹’籽油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸含量差異均不顯著(P>0.05)，3種脂肪酸含量依次為5.23%～5.76%，1.66%～2.03%，19.8%～21.6%，均以綿陽市游仙區較高，分別達到5.76%、2.03%和21.3%。

表2 12個‘鳳丹’采樣地種子表型性狀

不同小寫字母表示樣地間在0.05水平存在顯著性差異 (P<0.05)圖1 12個引種地‘鳳丹’種子含油率和蛋白質含量The different normal letters indicate the significant difference among sampling sites at 0.05 level (P<0.05)Fig.1 Oil content and protein content of seeds from 12 ‘Fengdan’ sampling sites

圖2 不同采樣地‘鳳丹’種子中主要脂肪酸成分含量Fig.2 Main fatty acid contents of ‘Fengdan’ seeds from different sampling sites

2.3 ‘鳳丹’種子各性狀相關性分析

‘鳳丹’種子性狀間的相關性分析結果(圖3)表明：千粒重與α-亞麻酸、亞油酸含量均具有極顯著相關關系，其中與α-亞麻酸呈極顯著正相關(0.760)，與亞油酸呈極顯著負相關(-0.701)；蛋白質與亞油酸、油酸含量具有極顯著相關關系，其中與亞油酸呈極顯著負相關(-0.686)，與油酸呈極顯著正相關(0.665)；α-亞麻酸與亞油酸含量呈極顯著負相關(-0.904)；棕櫚酸與硬脂酸含量呈極顯著負相關(-0.792)。

進一步對呈顯著相關的因子進行線性回歸分析，得到‘鳳丹’種子中α-亞麻酸含量與千粒重，亞油酸含量與千粒重、蛋白質含量和α-亞麻酸含量，油酸含量與蛋白質含量，以及硬脂酸含量與棕櫚酸含量的回歸方程(圖 4)。這為通過千粒重直接估算α-亞麻酸和亞油酸的質量分數以及各脂肪酸間的質量分數估算提供便利。

2.4 不同引種地‘鳳丹’種子品質與生態因子的關系

由表3可知，前兩個排序軸的累計解釋量達80.61%，說明排序結果可信，能較好地解釋2組變量的關系。由圖5可知，立地氣候對‘鳳丹’種子表型性狀和營養性狀具有重要影響，其中立地條件對其影響最大，貢獻率大小為速效鉀>有機質>海拔>堿解氮>有效磷>pH；氣候條件對其的貢獻率大小為全年日照>1月均溫>7月均溫>年降雨量>年均溫。速效鉀對種形指數和油酸的影響較大，有機質和堿解氮對蛋白質和含油率的影響較大，海拔對種子表型性狀的影響較大；同時海拔、速效鉀、有效磷、堿解氮和溫度等立地氣候因子與種子表型性狀、蛋白質、含油率、棕櫚酸和α-亞麻酸正相關程度大，與硬脂酸和亞油酸呈負相關。

*、**分別表示差異顯著水平為0.05和0.01。GW. 千粒重;P.含油率; pro. 蛋白質; C18∶3n3. α-亞麻酸; C18∶2n6c. 亞油酸; C16∶0.棕櫚酸; C18∶0. 硬脂酸; C18∶1n9c. 油酸圖3 ‘鳳丹’種子各性狀間相關性分析* and ** mean significant correlation between variables at 0.05 and 0.01 level. GW.1 000-grain weight; P. Oil content; pro. Protein content; C18∶3n3.α-Linolenic acid; C18∶2n6c. Linoleic acid; C16∶0. Palmitic acid; C18∶0. Stearic acid; C18∶1n9c. Oleic acidFig.3 Correlation coefficients among indexes of ‘Fengdan’ seeds

表3 種子性狀與地理氣候因子的RDA分析

圖4 ‘鳳丹’種子中顯著相關性狀間的回歸分析Fig.4 Regression analysis of significant correlation factors of ‘Fengdan’ seeds

Alt.海拔；MAT.年均溫；AT January.1月均溫；AT July.7月均溫；AAR.年降雨量；ASD.全年日照時數；PH.pH值；OM.有機質；K.速效鉀；P.有效磷； N.堿解氮；HD.橫徑；VD.縱徑；SSI.種形指數；TKW.千粒重；OR.含油率；Pr.蛋白質；ALA.α-亞麻酸；CLA.亞油酸；PA.棕櫚酸；SA.硬脂酸；OA.油酸圖5 ‘鳳丹’種子性狀與其立地地理氣候因子的典型相關性Alt. altitude; MAT. Annual average temperature; AT January.Average temperature of January; AT July. Average temperature of July; AAR. Annual precipitation; ASD. Annual sunshine duration; pH. pH; OM. Organic matter; K. Available K; P. Available phosphorous; N. Alkali-hydrolyzable nitrogen; HD. Iransverse diameter; VD. Longitudinal diameter; SSI. Seed shape index; TKW. Thousand-grain weight; OR, Oil content; Pr. Protein; ALA. α-Linolenic acid; CLA. Linoleic acid; PA. Palmitic acid; SA. Stearic acid; OA. Oleic acidFig.5 Canonical correlation analysis between ‘Fengdan’ seed traits and geo-meteorological factors

3 討 論

表型多樣性是遺傳多樣性和環境多樣性的綜合表現，對種子性狀進行差異比較和多樣性研究，可一定程度上反映該物種的遺傳變異大小，同時還能反映出形態變異對環境的適應關系[29-30]。本研究發現，不同采樣地‘鳳丹’種子各表型性狀均存在極顯著差異(P<0.01)，表明引種到四川盆地的‘鳳丹’會對不同生境做出差異響應，表型性狀變化就是其形式之一[31-32]。變異系數的差異反映了不同表型性狀對環境的不同適應能力[33]，變異系數越大，表型性狀差異越明顯，遺傳變異可能性越大。本研究中測定的表型性狀變異系數為8.08%～17.50%，說明這12個采樣地‘鳳丹’種子表現出較為豐富的遺傳多樣性，這與孫佳婷等[34]在臺灣欒樹(Koelreuteriaeleganssubsp.formosana)的表型遺傳多樣性評價的研究結果一致。可見，這些性狀在后期對育種材料進行選擇時具有較高參考價值，可作為目標評價體系中的重要指標進行觀測。其中，種形指數變異系數最大達到17.5%，而千粒重變異系數最小僅為8.08%，表明種形指數的變異水平高于千粒重性狀，千粒重受到環境的影響相對較小，更趨于穩定。此外，本研究測定的籽油中α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸含量變異幅度均較小(2.57%～6.07%)，遠低于表型性狀變異系數(8.08%～17.50%)，表明表型變異強度變異明顯高于營養性狀變異。‘鳳丹’自四川引種以來，長期適應不同的環境，可能導致相同的功能性狀在不同引種地間存在顯著差異。在不同的環境中，‘鳳丹’通過形態變化和表型性狀分化調整自身的生長發育及其與環境之間的關系，從而適應環境的變化，不同采樣地種子橫徑、縱徑大小沒有明顯的規律性，說明種子大小受地理因素的影響較小；種形指數表現出明顯的隨經度的增加逐步增大的規律。說明高經度地區‘鳳丹’種子則較窄長，而低經度地區的‘鳳丹’種子形態較寬短，可能與采樣地的經度跨度大且涉及的種子表型性狀數量多有關。

在選擇相關性極強的性狀組時，其中一個性狀改良可同時影響其他性狀改變，可在性狀選擇上提供不同的改良方向和選擇標準[35-36]。本研究通過比較‘鳳丹’種子各性狀間的相關性，發現‘鳳丹’種子含油率和蛋白質含量與表型性狀間無顯著相關關系，證明在所選表型性狀中不能對油用優良單株進行間接選擇；同時，本研究發現‘鳳丹’種子含油率和脂肪酸組分間也無顯著相關關系，而脂肪酸組分間具有不同的相關性，α-亞麻酸含量與亞油酸含量呈極顯著負相關，硬脂酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著正相關，該結果與向婷婷等對野生油茶種子中含油率和脂肪酸組分正相關的研究結果不一致[37]，可能是由于研究區域范圍和樹種差異造成的，但要提高‘鳳丹’籽油的綜合食用價值，不能僅將含油率作為唯一參照，還要兼顧其脂肪酸組分，特別是α-亞麻酸含量等。另外，本研究中千粒重與α-亞麻酸極顯著正相關，與亞油酸呈極顯著負相關，千粒重是油用牡丹產量性狀和品質指標的主要構成因素[38]，通過線性回歸分析以及建立回歸方程，可以為通過千粒重直接估算α-亞麻酸和亞油酸的質量分數以及各脂肪酸間的質量分數估算提供便利。

種子表型性狀受外界多種因子的影響，如海拔、年平均氣溫和經緯度等[39-40]。本研究發現土壤速效鉀、有機質含量和海拔等立地條件因子，以及全年日照、1月均溫和7月均溫等氣候條件因子對‘鳳丹’種子表型的貢獻率較大，這是因為土壤中速效鉀和有機質含量會影響植物種子中營養化學成分的積累[39]，海拔會影響不同采樣地的熱、水和土等條件的空間差異，形成復雜的生境，在經過長期的地理隔離和自然選擇間接影響種實的表型變異幅度[41]。同時，本研究還發現速效鉀對種形指數和油酸的影響較大，有機質對蛋白質和含油率的影響較大，該結果與潘苗等[42]和羅芊芊等[43]對南方紅豆杉的研究結果相近，這是因為鉀元素參與植物體內的某些代謝反應，具有提高含油量的作用，有機質含量對種子中營養化學成分影響顯著，從而促進植物體內有機物質合成和積累。另外，‘鳳丹’種子絕大部分性狀與地理氣象因子的相關性表現出一致的趨勢，主要表現為與經緯度、年平均氣溫呈正相關關系。這是因為經緯度和海拔的梯度變化能夠綜合反映氣溫、降水和植被等環境因子的作用[44]。本研究中采樣地海拔、土壤養分和溫度等因子與‘鳳丹’表型性狀、蛋白質、含油率、棕櫚酸和α-亞麻酸正相關程度較大，該結果與劉從等研究結果一致，認為植物體能夠通過形態變化和養分形成來適應環境的改變，即形態可塑性[45]。出現這種情況一方面是受長期自然選擇影響造成的自身遺傳變異特性，另一方面是由各環境因子綜合作用造成的主要營養成分含量變異[46]。

綜上所述，四川盆地不同區域引種栽培的‘鳳丹’種子表型性狀及主要營養成分含量具有顯著差異，氣象、土壤養分和海拔等生態因子對‘鳳丹’種子品質具有重要影響，在選擇‘鳳丹’種植基地時應充分考慮各地生態因子的差異，應選擇海拔、溫度較高，土壤養分(有機質、速效鉀、有效磷、堿解氮)豐富的地區。