孕婦外周血無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用*

紀(jì) 利 馬 莉 許海燕 曹亞莉 王 娜 韓英杰

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，濟(jì)寧 272011）

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（noninvasive prenatal testing，NIPT）是通過(guò)采集孕婦外周血（5ml），提取游離DNA，采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，得出胎兒患染色體非整倍性疾病（21三體又稱(chēng)唐氏綜合征，18三體，13三體）風(fēng)險(xiǎn)率的技術(shù)。此技術(shù)最早是1997年香港中文大學(xué)盧煜明教授在懷有男性胎兒的孕婦外周血中擴(kuò)增到了Y染色體的片段，正常女性體內(nèi)不含有Y染色體，從而證明了孕婦外周血中存在胎兒游離DNA，開(kāi)啟了探索NIPT新技術(shù)的思路[1]。NIPT技術(shù)以安全、簡(jiǎn)單、實(shí)用等特點(diǎn)在臨床得到廣泛應(yīng)用。NIPT臨床應(yīng)用指征和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值評(píng)價(jià)尚不完善。本文通過(guò)本中心的研究數(shù)據(jù)，對(duì)NIPT陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和假陽(yáng)性等進(jìn)行比較分析，從而探討NIPT在胎兒染色體非整倍體的診斷中應(yīng)用價(jià)值，為該技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的合理應(yīng)用提供良好的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料

本中心收集2016年1月－2019年12月在濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院行NIPT孕婦共8828例，其中高齡孕婦選擇NIPT 4200例，血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)643例，血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)2200例，超聲軟指標(biāo)異常338例，雙胎／IVF-ET 634例，錯(cuò)過(guò)唐篩選擇NIPT替代108例，拒絕唐篩要求NIPT 610例，其他95例。見(jiàn)表1。本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 2016－2019年孕婦行NIPT的臨床因素分析（n）

1．2 方法

1.2.1 試劑和儀器 無(wú)創(chuàng)DNA的試劑盒采用貝瑞和康試劑盒，采用貝瑞和康NextSep CN500測(cè)序平臺(tái)。羊水穿刺采用Thermo培養(yǎng)箱，芯片采用Human CytoSNP-12芯片。羊水培養(yǎng)基采用白云山細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 NIPT檢測(cè) 抽取孕婦外周血5ml用EDTA抗凝，提取血漿游離DNA，采用NextSep CN500高通量測(cè)序儀檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)行高通量分析，并通過(guò)生物信息學(xué)分析計(jì)算Z值，正常值為Z值介于-3～3之間，當(dāng)Z值＞3，三體高風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng) Z值＜-3，單體高風(fēng)險(xiǎn)。NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行羊水穿刺驗(yàn)證結(jié)果，判斷有無(wú)假陽(yáng)性。NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前、產(chǎn)后電話追蹤隨訪，判斷有無(wú)假陰性。

1）核型染色體制備。受檢者妊娠孕周均在18～32周，B超定位經(jīng)腹部羊水穿刺取樣，每次取羊水量20～30ml，將新鮮羊水移入20ml離心管，室溫，1700～1800r／min離心10min，吸去上清液，留約0.5ml，分別接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，采用G顯帶法，進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析。

2）基因芯片技術(shù)。采集羊水10ml并提取gDNA（QIAGEN）。擴(kuò)增產(chǎn)物DNA取4μl進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，兩輪擴(kuò)增后的產(chǎn)物繼續(xù)按照說(shuō)明書(shū)（Infinium＠HD Assay Super，Manual Protoc01）操作，經(jīng)過(guò)一系列的酶終止，變性后與Human CytoSNP-12芯片（Illumina，美國(guó)）雜交，再經(jīng)過(guò)染色、信號(hào)放大后進(jìn)行芯片掃描，用 Karyostudio（version1.4.3 Illumina）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用n表示。NIPT高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果與羊水穿刺結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性和假陽(yáng)性例數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 2016－2019年NIPT高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果與羊水穿刺結(jié)果分析

2016－2019年NIPT高風(fēng)險(xiǎn)123例，其中21三體高風(fēng)險(xiǎn)38例、18三體高風(fēng)險(xiǎn)12例、13三體高風(fēng)險(xiǎn)5例、性染色體高風(fēng)險(xiǎn)和其他染色體高風(fēng)險(xiǎn)56例和12例。通過(guò)羊水穿刺介入性產(chǎn)前診斷確診21三體28例，假陽(yáng)性例數(shù)10例；18三體7例，假陽(yáng)性例數(shù)5例；13三體1例，假陽(yáng)性例數(shù)1例；性染色體異常17例，假陽(yáng)性例數(shù)39例；其他染色體異常4例，假陽(yáng)性例數(shù)8例。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為73.7%、58.3%、20.0%、30.4%、33.3%。見(jiàn)表2、3。

表2 2016－2019年NIPT高風(fēng)險(xiǎn)例數(shù)、羊水穿刺確診例數(shù)以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分析（n）

表3 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果和羊水穿刺確診結(jié)果分析

2．3 隨訪結(jié)果

所有NIPT孕婦進(jìn)行電話隨訪。NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦123例，行羊水穿刺104例，確診染色體異常57例，其中引產(chǎn) 55例，1例胎兒性染色體 47（XYY），羊水穿刺確診后，要求繼續(xù)妊娠，分娩后隨訪新生兒出生后6個(gè)月未發(fā)現(xiàn)異常；1例胎兒性染色體47（XXY），羊水穿刺確診后，要求繼續(xù)妊娠，分娩后隨訪新生兒出生后6個(gè)月未發(fā)現(xiàn)異常。未行羊水穿刺19例，4例21三體高風(fēng)險(xiǎn)胎兒超聲異常引產(chǎn)；2例18三體高風(fēng)險(xiǎn)，超聲胎兒多發(fā)畸形引產(chǎn)；1例13三體高風(fēng)險(xiǎn)，超聲NT 4.0mm引產(chǎn)；4例性染色體高風(fēng)險(xiǎn)拒絕羊水穿刺分娩后隨訪新生兒正常；有8例失訪病歷。NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦行電話隨訪未發(fā)現(xiàn)新生兒發(fā)育異常。

3 討論

我國(guó)出生缺陷發(fā)生率高達(dá)5.6%[2]，國(guó)家推行出生缺陷三級(jí)預(yù)防策略中，產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷率重要的二級(jí)預(yù)防。侵入性產(chǎn)前診斷可導(dǎo)致流產(chǎn)、胎膜早破、感染等并發(fā)癥，傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)如羊水穿刺等，約0.5%～0.86%胎兒丟失率[3]。因此外周血NIPT以無(wú)創(chuàng)性和相對(duì)較高的準(zhǔn)確性在臨床上獲得了較廣泛的應(yīng)用。

在NIPT檢測(cè)技術(shù)的臨床評(píng)價(jià)中，包含兩方面：一是NIPT選擇的臨床應(yīng)用指征，是否適用；二、NIPT的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的比較。通過(guò)對(duì)NIPT的臨床應(yīng)用指征統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，臨床中選擇做NIPT的孕婦以高齡孕婦為主（4200／8828）。國(guó)家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的《高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范（試行）》，指出高齡（≥35歲）為NIPT的慎用人群。高齡孕婦選擇做NIPT的比例最高，一方面是我國(guó)國(guó)情所致，2016年二胎政策放開(kāi)后大量的高齡孕產(chǎn)婦的出現(xiàn)[4]，使得高齡孕婦占妊娠總數(shù)的比例明顯增高。另一方面，高齡孕婦對(duì)侵入性產(chǎn)前診斷流產(chǎn)、感染等風(fēng)險(xiǎn)接受較差。一項(xiàng)大型病例隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)≥35歲孕產(chǎn)婦在人群中的自然流產(chǎn)率≥25%[5]。從既往地統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，高齡孕婦引起胎兒染色體疾病的比例顯著增加。以最常見(jiàn)的唐氏綜合征為例，發(fā)生率約為妊娠的 1／500與出生兒的 1／（800～1000），而在35歲以上的高齡孕婦，唐氏綜合征的發(fā)生率增加至 1／（200～270）[5]，所以在臨床咨詢中一定要注意NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷的指征選擇，尤其是高齡孕婦。對(duì)于21、18和13三體綜合征產(chǎn)前篩查來(lái)說(shuō)，NIPT是目前最敏感的檢測(cè)技術(shù)手段[6]。但是我們也要有一個(gè)明確的認(rèn)識(shí)，NIPT只能算一個(gè)深度篩查技術(shù)，并不是傳統(tǒng)意義上診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，故NIPT的慎用人群首選侵入性產(chǎn)前診斷，且NIPT高風(fēng)險(xiǎn)人群需要進(jìn)一步侵入性產(chǎn)前診斷如羊水穿刺進(jìn)行確診[2]。

通過(guò)表2、表3的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。2016-2019年NIPT共發(fā)現(xiàn)非整倍體及其他染色體高風(fēng)險(xiǎn)病例123例，其中21三體38例，18三體12例，13三體5例，性染色體56例，21三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為73.7%（28／38），18三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 58.3%（7／12），13三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 20.0%（1／5），性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為30.4%（17／56），其中以21三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最高，13三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最低，檢測(cè)技術(shù)中每個(gè)染色體異常均存在假陽(yáng)性例數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NIPT對(duì)于21三體的檢出率為94.4%～100%，平均 99.7%[7]，本文 21三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為73.7%，數(shù)值偏低可能由于部分高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，因?yàn)槌暜惓Ｖ苯舆x擇了引產(chǎn)術(shù)，而未行羊水穿刺進(jìn)一步確診。13三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最低，有研究表明可能是由于13號(hào)染色體的鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸和胞嘧啶脫氧核糖核苷酸含量較低，導(dǎo)致測(cè)序時(shí)出現(xiàn)誤差，或由于13三體孕婦的胎盤(pán)較小，釋放入母血的游離胎兒DNA數(shù)量相對(duì)減少造成的[8]。對(duì)于NIPT低風(fēng)險(xiǎn)病人，雖然沒(méi)有羊水穿刺進(jìn)一步確診，但是我院通過(guò)分娩后隨訪未發(fā)現(xiàn)假陰性結(jié)果。

綜上所述，孕婦外周血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)雖然無(wú)創(chuàng)，但是也存在假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果[9－10]，所以NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦需要進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷。NIPT低風(fēng)險(xiǎn)，僅僅說(shuō)明胎兒罹患21、18、13三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn)較低，并不能說(shuō)明其他染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)也較低，同時(shí)也不除外出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能性。對(duì)于NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦，一定要建議定期產(chǎn)檢，嚴(yán)格進(jìn)行排畸超聲檢查。NIPT技術(shù)對(duì)21三體綜合征具有較高的準(zhǔn)確率，又因無(wú)創(chuàng)操作，故單純高齡孕婦選擇較多。NIPT可作為篩查手段，而對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，需要臨床咨詢?nèi)藛T明確告知NIPT的利弊，仍然建議首選羊水穿刺等侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)[11-12]。

當(dāng)然，隨著檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步的提高，我們期待NIPT技術(shù)更好的發(fā)展，有更寬的檢測(cè)范圍和更高的準(zhǔn)確率，以降低侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。