毒根斑鳩菊花枝總黃酮的提取工藝*

賈紫菲 王盈盈△ 王開明 李 霄 白 瑤 周鳳玲

（1濟寧醫學院基礎醫學院；2山東理工職業學院能源與材料工程學院，濟寧 272067）

毒根斑鳩菊（Vernonia cumingiana Benth）為斑鳩菊屬（Vermonia），是含有1000多種植物的菊科（Compositae）大屬，主要分布于福建、臺灣、廣東、海南、廣西等地。斑鳩菊屬植物中分離得到的化學成分種類較多，且含有多樣生物活性，包括苯丙素類、甾體、萜類[1-3]、黃酮類[4]、脂肪酸等[5]。其藥理學研究表明，該屬植物具有抗腫瘤[6]、抑菌[7]、抗炎[8]、免疫和抗感染活性[9-11]，目前關于其黃酮提取的報道很少。本實驗采用正交試驗方法從毒根斑鳩菊提取總黃酮，利用紫外分光光度法測定總黃酮的含量，為開發和利用毒根斑鳩菊資源提供了重要的理論基礎。

1 儀器與材料

1．1 樣品來源

本實驗所用毒根斑鳩菊花枝樣品于2019年1月采自于海南省昌江黎族自治縣，由青島科技大學化學與分子工程學院鐘惠民教授鑒定。憑證樣品保存于濟寧醫學院分子醫學與化學實驗室。

1．2 儀器與試劑

蘆丁標準品（CAS：153-18-4 C27H30O16，MW：610.52，如吉生物科技公司）；甲醇、硝酸鋁、蒸餾水、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲機（杭州蕭山余祝超聲波設備廠）；移液槍（美國thermo熱電移液器）；紫外可見分光光度計5100UV（上海元析儀器有限公司）。

2 方法與結果

2．1 蘆丁標準品制備

在50 mL容量瓶中精準稱取蘆丁標準品20 mg，將其溶解在甲醇中并稀釋至容量瓶標線，使溶液的濃度為 0.40 mg·mL－1。

2.1.1 測定波長選擇 于10mL玻璃比色管中加入1.00 mL上述標準品溶液，再依此加入CH3OH溶液4.00 mL 5%NaNO2溶液0.60 mL，旋渦混合器混勻于 6 min后，再加入 10%Al（NO3）3溶液0.60 mL，旋渦混合器混勻，靜置 6 min，最后加入10%氫氧化鈉3.00 mL后并以CH3OH溶液定容至刻度線，搖勻，得空白、對照品溶液，將上述溶液靜置15 min后，空白不加標準品溶液，利用紫外分光光度法在400～800 nm波長范圍內測定上述標準液的吸光度值A[12]，最后確定其測定波長為510 nm。

2.1.2 蘆丁標準曲線繪制 在25 mL容量瓶中，分別加入制備好的標準品溶液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，再依此加入 CH3OH溶液4.00 mL、5%NaNO2溶液0.60 mL，旋渦混合器混勻于 6 min后，再加 10%Al（NO3）3溶液 0.60 mL，旋渦混合器混勻，靜置6 min，最后加入10%氫氧化鈉3.00mL后并以CH3OH溶液定容至刻度線，得空白、對照品溶液，15min后，于510 nm波長處測定吸光度值A。依照回歸線方程y＝6.7882x＋0.0230，R2＝0.9952，橫坐標為蘆丁濃度，縱坐標為吸光度值A，得回歸曲線顯示各點分布均勻一致，呈正相交。見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2．2 樣品液制備及總黃酮含量的測定

精確稱取0.50 g毒根斑鳩菊花枝粉末用95%乙醇10 mL溶解，采用超聲波提取，將提取液過濾后并減壓濃縮，用CH3OH溶液于50 mL容量瓶對濃縮液定容。用移液槍量取0.10 mL的上述樣品液，按“2.1.2”的操作方法測定吸光度值A，總黃酮含量由回歸方程計算得出。

2．3 單因素試驗

2.3.1 超聲波功率 取10 mL 95%乙醇溶液溶解精確稱取的毒根斑鳩菊花枝粉末0.50 g，分別按照60、180、300、420、540和 780W的超聲功率梯度進行提取30 min后，過濾并減壓濃縮，用50 mL容量瓶以CH3OH溶液定容，按照＂2.1.2＂項步驟測吸光度A，據回歸方程計算總黃酮含量。由圖2得出，總黃酮提取含量總體表現為先升高后降低，功率為300～420W時黃酮量變化不明顯。當超聲波功率達540 W時，提取的總黃酮含量最高。由此可以得出最佳超聲波功率為540W。

圖2 超聲波功率對毒根斑鳩菊花枝總黃酮提取效果的影響

2.3.2 提取溫度 取10.00 m l的95%乙醇溶解精確稱取的毒根斑鳩菊花枝粉末0.50 g，分別在溫度梯度為30℃、50℃、60℃、70℃、80℃，超聲提取30 min后，過濾并減壓濃縮提取液，用50 mL容量瓶以CH3OH溶液定容，按照＂2.1.2＂項步驟測取吸光度值A，結合回歸方程得黃酮含量。由圖3得出，曲線在初始階段變化不明顯，當溫度超過50℃時，逐漸遞增，且增幅較大。一旦溫度超過70℃時，總黃酮含量開始降低，可能是由于溫度升高導致黃酮化學結構的破壞，從而使部分失活，由此得知當提取溫度為70℃時，總黃酮含量可達至最大值，發揮最大效應。

圖3 提取溫度對毒根斑鳩菊花枝總黃酮提取量的影響

2.3.3 乙醇濃度 用10mL的乙醇溶解毒根斑鳩菊花枝粉末0.50 g，乙醇濃度梯度為10%、30%、50%、70%、90%、100%，超聲提取后過濾并減壓濃縮，于50 mL容量瓶中以CH3OH溶液定容。按照“2.1.2”項步驟測取吸光度值A，由回歸方程計算總黃酮含量。由圖4得出，隨乙醇濃度的增大，總黃酮提取總量逐漸升高，在乙醇濃度為70%時達其高峰，隨之大幅下降。因此，確定最佳提取乙醇濃度為70%。

圖4 乙醇濃度對毒根斑鳩菊花枝總黃酮提取效果的影響

2.3.4 料液比 精密稱取毒根斑鳩菊花枝粉末0.50 g，10 mL 95%乙醇溶解，按料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和 1∶50 g／mL，之后在超聲條件下提取30min，甲醇定容至50mL，按照“2.1.2”項步驟測取吸光度值A，由回歸方程計算總黃酮含量。由圖5得出，在初始階段時，黃酮含量變化不明顯，之后便大幅上升，達其峰值，對應料液比是1∶20 g／mL。峰值后的曲線呈明顯的下降趨勢，當料液比繼續增大時，總黃酮含量卻呈降低狀態，說明過大的料液比并不利于總黃酮的提取。因此，選用1∶20 g／mL料液比為最宜。

圖5 料液比對毒根斑鳩菊花枝總黃酮提取效果的影響

2.3.5 提取時間 精密稱取毒根斑鳩菊花枝粉末0.50 g，10 mL 95%乙醇溶解，超聲下分別提取10、20、30、50和70 min后過濾并減壓濃縮，用50 mL容量瓶以甲醇定容，按照“2.1.2”步驟來測取吸光度A，結合回歸方程得黃酮含量。由圖6得出，有一明顯單峰，對應橫坐標值為70 min，黃酮含量為最大。70 min后，繼續延長時間，總黃酮含量反而有所降低。因此，確定最佳提取時間為70 min。

圖6 毒根斑鳩菊花枝總黃酮含量在不同提取時間下的效果圖

2．4 正交試驗

根據上述各因素實驗所得結果，設計正交試驗L16（45）表。對毒根斑鳩菊花枝總黃酮含量計算按照“2.1.2”的操作方法，由此來確定最佳的毒根斑鳩菊花枝總黃酮含量的提取條件。見表1。

表1 L16（45）正交實驗設計

由表2的5個因素4個K值大小可以得出以下結論，A種因素 A3＞A2＞A1＞A4，B種因素 B1＞B2＞B3＞B4，C種因素 C4＞C2＞C3＞C1，D種因素 D3＞D2＞D1＞D4，E種因素 E4＞E1＞E2＞E3，正交實驗結果見表2。

表2 正交實驗結果

2．5 試驗方法的考察

2.5.1 精密度試驗 稱1.00mL蘆丁標準品溶液共5份，按“2.1.2”項操作于λ＝510 nm處測得吸光度后計算RSD值為1.29%（n＝5）。

2.5.2 顯色穩定試驗 精密稱取毒根斑鳩菊花枝樣品的溶液0.10 mL到試管中后加入4.90 mL甲醇，按照“2.1.2”項的操作方法進行顯色，空白對照管不加入 NaNO2的溶液，分別在 0、10、20、30、40 min測1次吸光度值，做5次平行實驗后計算毒根斑鳩菊花枝中總黃酮含量，經過計算得到的RSD值為1.67%（n＝5）。

2.5.3 方法重現性試驗 稱5份5.00g花枝粉末根據最佳提取條件提取總黃酮，過濾、減壓濃縮，在100 mL容量瓶中加入斑鳩菊花枝濃縮液并用甲醇定容。將0.10 mL的花枝提取液置于比色管并用甲醇定容至5 mL，按“2.1.2”項方法顯色并測定其吸光度，算得RSD值為0.97%（n＝5）。

2.5.4 回收率試驗 稱5.00 g毒根斑鳩菊花枝5份，于最佳提取條件下進行提取總黃酮，按“2.1.2”項操作顯色并于λ＝510 nm處測吸光度后計算RSD值為0.96%（n＝5），加樣回收率為99.10%。

2.5.5 試驗方法結果 根據蘆丁標準曲線方程可知，在濃度為 0.005～0.070 mg·mL－1時，其質量濃度與吸光度之間呈良好的線性關系；穩定性、回收率、精密度和重現性試驗的RSD值都小于2%，因此可以得出，此方法有良好的加樣回收率、重復性穩定性與精密度；表3所示為驗證實驗結果，毒根斑鳩菊花枝中總黃酮平均含量為81.59 mg·g－1，表3所作3次平行試驗的RSD值為1.58%（n＝3），兩者均比正交試驗表中的值高，由此可以確定A3B1C4D3E4為最佳提取工藝條件。

表3 驗證試驗結果

3 結論

正交試驗是一種科學便利的實驗方法，有快速、高效率、經濟、簡單易行的特點，多因素綜合結果可由其直接得出，無論單味藥[13]還是組方藥[14]，提取工藝試驗都可通過正交試驗驗證。本研究通過正交試驗法優化了毒根斑鳩菊花枝總黃酮的提取工藝，并進行了3次平行試驗進行驗證得到最佳提取條件為：超聲波功率540 W、溫度70℃、乙醇70%、料液比 1∶20g／mL、提取時間 70 min為最佳提取條件。此時參數組合為A3B1C4D3E4。得到的毒根斑鳩菊花枝中總黃酮含量為81.59 mg·g－1。綜上所述，影響毒根斑鳩菊花枝總黃酮提取因素排列為：提取時間＞料液比＞乙醇濃度＞超聲波功率＞提取溫度。該實驗工藝簡單、成本低、穩定可行、重復性好、提取效率較高，具有良好的應用前景，為毒根斑鳩菊進一步科學研究和開發新的天然抗氧化劑和保鮮劑提供了理論基礎。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。