球形納米金與牛血清白蛋白的相互作用*

李文博 史宏超 林英豪 李 淼 李 姝 劉曉陽 徐 靜 徐香玉△

（1濟寧醫學院基礎醫學院，濟寧 272067；2濟寧醫學院附屬醫院，濟寧 272029）

因納米材料具有較好的韌性[1]和較低的熔點，故許多納米粒子，包括金[2]、銀[3-4]、鉑[5]都得到了廣泛研究。在生命科學領域，基于納米金良好的生物相容性使得納米金可以作為體外成像的對比劑[6-7]，從而應用于體外成像。基于納米金與蛋白質相互作用[8]，可以用于光熱療法[9-10]，從而達到體內治療的目的。另外，納米金可應用于癌癥的診斷和治療[11-14]。

蛋白質是一切生命的物質基礎，生物體內各種化學反應都離不開蛋白質的參與[15]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是牛肝細胞中合成的蛋白，其可與多種內源性和外源性物質結合[16-17]。

本文以球形納米金與BSA作為研究對象，運用光譜、色譜等技術研究兩者的相互作用，為金納米材料在生物醫學等領域的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O，天津市博迪化工有限公司）；氯金酸（HAuCl4，國藥集團化學試劑有限公司）；抗壞血酸（北京百靈威科技有限公司）；硼氫化鈉（NaBH4，純度 98%，Alfa公司）；溴代十六烷基三甲胺銨（CTAB，C19H42NBr，純度99%，北京欣科中晶生物科技有限公司）；BSA（純度 99%，Mw＝66.0kg·mol－1，北京欣科中晶生物科技有限公司）；羥甲基氨基甲烷（Tris，Alfa公司）；BSA溶液在4℃ 冰箱中保存；試驗中所用的水均為三次去離子水。

電子天平（EL 204，梅特勒-托利多儀器有限公司，上海），紫外分光光度計（島津 UV-2501PC，日本），熒光光度計（日立F-4600，帶恒溫樣品支架，型號為250-0346，日本），德國艾本德可調移液器，優普系列超純水器（UPD-II-10T，四川）。

1．2 方法

1.2.1 球形納米金的制備 將20mL氯金酸（2.5×10－4mol·L－1）和檸檬酸三鈉（2.5×10－4mol·L－1）在燒杯中混合。然后，邊攪拌邊加入0.6mL 0.1mol·L－1的NaBH4溶液，此后混合溶液立刻變為粉紅色，表明形成了金種子。在2～5h內此溶液可用作種子溶液。在此實驗中檸檬酸鹽用作封端劑，得到的金種子直徑為3.5nm。

金納米制備采用三步種子法。將3個試管分別標記A、B、C，每個試管中都含有9.0mL 2.5×10－4mol·L－1HAuCl4和 0.1mol·L－1CTAB生長液。在每個試管中都加入0.05mL 0.1mol·L－1的抗壞血酸溶液。然后，將1.0mL金種子溶液與樣品A混合。A溶液顏色在2～3min內變紅。4～5h后，從試管A中取出1.0mL溶液加入試管B中，然后混合均勻。溶液B在4～5min內呈紅色。4～5h后，從試管B中取出1.0mL溶液加入試管C中，然后混合均勻。溶液在10min內呈紅色，所得溶液即為球形納米金。

1.2.2 紫外光譜測定 利用紫外分光光度計，在200nm到900nm的掃描范圍內，以1200nm／min的速度來測定溶液吸光度。固定比色皿中BSA的濃度為 0.13μmol·L－1，改變球形納米金的濃度依次為：0、0.83×10－5、2.50×10－5、4.17×10－5、5.83×10－5、7.50×10－5和 9.17×10－5mol·L－1，測定兩者相互作用的紫外光譜圖。

1.2.3 熒光光譜測定 利用熒光分光光度計，激發波長為280nm，相對應掃描波段為300nm到500nm，發射和激發狹縫的寬度均設定為5nm。固定比色皿中 BSA溶液的濃度為0.13μmol·L－1，球形納米金的濃度同1.2.2，測定兩者相互作用的光譜圖。

1.2.4 變溫熒光光譜測定 變溫熒光是測定球形納米金與BSA結合能力大小的有效方法，本實驗利用熒光分光光度計，測定了當激發波長為280nm時，球形納米金與BSA在298K、303K、308K時的熒光強度，其中 BSA的濃度為 0.13μmol·L－1，球形納米金的濃度同1.2.2，測定兩者相互作用的光譜圖。

1.2.5 圓二色譜測定 實驗所用儀器為J-810圓二色譜儀（日本），此儀器帶有程序控溫系統控制的Jasco溫控儀，光源系統用氮氣保護（流量為5L·min－1），掃描速率為 100nm·min－1，掃描波段為220～320nm，掃描結果是此范圍內的二次平均值，并且以千分度（mdeg）表示。

2 結果與討論

2.1 球形納米金與BSA相互作用的紫外光譜分析

金屬粒子在紫外可見光區有吸收帶或者吸收區，這是由于等離子共振激發或者帶間躍遷形成的吸收[18]。球形納米金在560nm處有最大吸收峰（圖1）。空白BSA溶液的吸收峰在280nm左右，隨著不同濃度球形納米金溶液的加入，BSA的紫外吸收強度隨之有規律地遞增，即隨著球形納米金濃度的增加，BSA的溶液發生了增色效應，且其特征吸收峰由278nm藍移到了268nm，此結果表明，球形納米金與BSA發生了相互作用。見圖2。

圖1 球形納米金的紫外吸收光譜圖

圖2 球形納米金與BSA相互作用的紫外可見吸收光譜圖

2．2 熒光光譜分析

在BSA分子中，存在3個固有的熒光殘基：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），BSA與其他物質相互作用而導致其熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。隨著溶液中球形納米金濃度的增加，BSA的熒光強度不斷降低，熒光峰逐漸藍移（向左移動了約15nm），說明球形納米金與BSA發生了相互作用，這種作用可能引起BSA中熒光發色團的微環境及蛋白質分子構象行為的變化（圖3）。結合紫外光譜圖，可以得知球形納米金不僅與BSA發生相互作用，還使其結構發生了變化。

圖3 球形納米金與BSA相互作用的熒光光譜圖

2．3 熒光猝滅機制

為了更好地理解球形納米金與BSA的相互作用機理，本實驗開展了298K、303K、308K的變溫熒光實驗。熒光猝滅機理通常分為靜態猝滅和動態猝滅，動態猝滅遵循 Stern-Volmer方程[19]：

其中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑物質的熒光強度；[Q]為猝滅劑的濃度；Ksv是動態猝滅常數；Kq為猝滅速率常數；τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10－8s。而靜態猝滅過程遵循下式：

式中，Ks是靜態猝滅常數。隨溫度升高，動態猝滅常數會增大，而靜態猝滅常數隨之減小，可由此判斷熒光猝滅類型。也可以通過比較Kq值來區分，如果Kq值大于生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數（2.0×1010L·mol－1·s－1），則靜態猝滅為主要作用機理，反之，則為動態猝滅。通過F0／F作圖（見圖4），可以確定Ksv的數值（見表1），如表所示，Ksv的值均隨著溫度上升而增大，但由于Kq均遠大于 2.0×1010L·mol－1·s－1，說明球形金納米對BSA的熒光猝滅以靜態猝滅為主。

圖4 不同溫度下球形納米金對BSA猝滅的Stern-Volmer方程圖

表1 不同溫度下球形納米金與BSA相互作用的猝滅常數

2．4 熱力學參數及作用力分析

熒光猝滅是猝滅劑和熒光物質激發態分子的相互作用過程，為了更好地理解球形納米金與BSA相互作用的機理，還分析了熒光強度與猝滅劑之間的關系。對于靜態猝滅來說，可以用方程Doublelogarithm（公式3）來探討。

式中F和F0分別為有無球形納米金存在時牛血清白蛋白溶液的熒光強度，[Q]為球形納米金的濃度。以 log（F0－F）／F對 log[Q]作圖，由圖 5的直線斜率和截距可求出球形納米金與BSA分子的Hill常數n和平衡常數Ka，見表2。由數據可知，隨著溫度的升高，結合常數和n均減小，也就是說隨著溫度的升高，BSA與球形納米金的結合能力降低。分子間的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等。當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH可認為是常數。由熱力學公式（4，5）可以計算出不同溫度下球形納米金和BSA相互作用的熱力學參數，見表3。由ΔG＜0可知兩者之間的相互作用是自發進行的。另外，ΔH＜0和ΔS＜0，根據Ross等[20]總結的熱力學規律可推斷出球形納米金與BSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力。

圖5 不同溫度下球形納米金對BSA猝滅的雙倒數方程圖

表2 在不同溫度下球形納米金與BSA的結合常數和Hill常數

表3 球形納米金與BSA相互作用的熱力學參數

2.5 3D熒光光譜分析

球形納米金與BSA相互作用后，峰位a（λex＝λem）為瑞利散射峰，其峰強度增加，峰位b（λex＝2λem）為二階散射峰，其峰強度降低。峰1（λex＝280.0nm，λem＝351.5nm）為色氨酸和酪氨酸殘基的特征峰，其強度降低。峰 2（λex＝225.0nm，λem＝351.5nm）為多肽骨架的特征峰，其強度也發生了降低。此實驗結果表明，球形納米金與BSA之間確實發生了相互作用，并且納米材料的存在改變了蛋白質的肽鏈結構。見圖6。

圖6 球形納米金與BSA相互作用的3D熒光光譜圖

2.6 圓二色（CD）光譜分析

為了研究相互作用過程中BSA分子的結構變化，開展了圓二色譜實驗（CD）。BSA分子的圓二色譜在紫外區域的208nm和220nm處存在兩個負的肩縫，這是典型的蛋白質α-螺旋結構[21]。兩個肩縫強度都顯著的減少，這說明蛋白質結構中α-螺旋結構含量減少了。α-螺旋結構含量的減少表明球形納米金與蛋白質多肽鏈的氨基酸發生了相互作用。然而，在有無球形納米金時，BSA分子的圓二色光譜的形狀較相近，這意味著當加入球形納米金之后BSA分子的結構仍然是α-螺旋結構占主導地位。見圖7。

圖7 球形納米金與BSA相互作用的圓二色譜圖

3 結論

本論文合成并表征了球形金納米粒子，利用紫外可見光譜、熒光光譜以及圓二色譜相結合的方法研究了其與BSA的相互作用。由實驗結果可知，隨著球形納米金濃度的增加，BSA的紫外吸收峰強度有所增加，而熒光強度卻降低。利用變溫熒光實驗得到了兩者相互作用的吉布斯自由能變、熵變、焓變等熱力學參數，得知熒光猝滅機理是靜態猝滅。加入球形納米金之后，BSA分子結構仍然是α-螺旋結構占主導地位。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。