光照通過(guò)褪黑素影響浙東白鵝肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的研究

沈龍仙，張 晨，汪 涵，袁瓊雨，楊松柏，周曉龍，趙阿勇

（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江臨安 311300）

光作為一種非生物因素，會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)速率、代謝活動(dòng)、性成熟和繁殖等，對(duì)大多數(shù)生物的生命有重要作用。延長(zhǎng)日照時(shí)間可以增加魚(yú)類的生長(zhǎng)速度[1]、影響肉雞的采食量和生長(zhǎng)率，也會(huì)影響骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)生率[2]。肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育受一系列生肌決定因子時(shí)空上的精密調(diào)控，根據(jù)這些因子的結(jié)構(gòu)和作用模式可以分為相對(duì)獨(dú)立的家族，如生肌調(diào)控因子家族（MRFs）、肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2 家族（MEF2）、轉(zhuǎn)化因子β超家族（TGF-β）、配對(duì)框家族（Pax）等。然而，關(guān)于光照管理技術(shù)對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的影響少有報(bào)道，其相關(guān)的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

鵝屬于季節(jié)性繁殖動(dòng)物，光照對(duì)其影響很大。合適的光照程序可以通過(guò)延長(zhǎng)產(chǎn)蛋期和縮短休產(chǎn)期來(lái)提高鵝的產(chǎn)蛋性能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同光照組之間的肌肉特異性基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，表明魚(yú)類肌肉生長(zhǎng)過(guò)程的調(diào)控機(jī)制依賴于光周期的持續(xù)時(shí)間[1]。因此，推測(cè)光照可能會(huì)影響浙東白鵝肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。MLT 是一種由松果體分泌的多功能吲哚類激素，其分泌具有晝夜節(jié)律和季節(jié)性節(jié)律，并且對(duì)光照非常敏感。本試驗(yàn)檢測(cè)了浙東白鵝在不同光照模式下的血清MLT 含量，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析肌肉特異性基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)MLT 含量發(fā)生了顯著變化，因此在C2C12 細(xì)胞上開(kāi)展了一系列初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MLT 對(duì)肌肉特異性基因的作用，為進(jìn)一步提高家禽生長(zhǎng)性能和促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 總RNA 提取試劑Trizol（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 5X All-In-One RT Master Mix（南京曼夫特生物科技有限公司）；SYBR?Premix Ex TaqTM II 試劑盒（新貝生物科技有限公司）；C2C12 細(xì)胞（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司）；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA 1X，Thermo Fisher 公司）；12 孔板和細(xì)胞培養(yǎng)皿（杭州昊鑫生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn) 試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為2 個(gè)月，選取32 周齡體型大小相似、體況良好的浙東白鵝母鵝16 只，隨機(jī)分成2 組，每組8 只。2 個(gè)試驗(yàn)組分別接受長(zhǎng)光照（15L:9D）和短光照（9L:15D）。按正常的飼養(yǎng)管理模式進(jìn)行，內(nèi)設(shè)飲水器，每天喂料2 次（07:00 和17:00）。盡量保持舍內(nèi)衛(wèi)生、干燥。自由采食、自由飲水。在40 周齡對(duì)其進(jìn)行屠宰，每組隨機(jī)抽取4 只鵝，取靜脈血5 mL用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。同時(shí)取所有鵝的同側(cè)腿肌組織部位，置于液氮速凍，-80℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 C2C12 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中迅速取出凍存的C2C12 細(xì)胞，放入提前預(yù)熱至37℃的水浴鍋中，不斷搖晃凍存管，在快要融化的時(shí)候取出，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管內(nèi)，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基吹打均勻，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清液，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將其轉(zhuǎn)移至10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于含5% CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：培養(yǎng)瓶中的C2C12 細(xì)胞貼壁面積達(dá)到80%左右時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS 清洗棄去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5 min 左右，加入1 mL 細(xì)胞終止液終止消化。吹打混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心5 min。吸棄上清液，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打混勻，分裝至2 個(gè)10 cm 培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞鋪板：待細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS 清洗棄去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5 min 左右，加入1 mL 細(xì)胞終止液終止消化。吹打混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打混勻，用12 孔板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，將細(xì)胞分組培養(yǎng)在含添加不同MLT 濃度（0、0.1、1.0、10 ng/mL）的DMEM 高糖培養(yǎng)基中。

1.3.2 體外培養(yǎng)C2C12 細(xì)胞不同時(shí)期的RNA 提取 細(xì)胞鋪板24 h 后收集提取各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后置于-20℃凍存。以GAPDH為內(nèi)參基因，對(duì)肌肉發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)分析。

選擇適宜的褪黑素濃度進(jìn)行C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)，將細(xì)胞分組培養(yǎng)在該濃度下的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組培養(yǎng)在無(wú)褪黑素處理的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，收集提取30%、50%、70%、90%細(xì)胞融合度的細(xì)胞RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 操作。

1.4 總RNA 的提取和cDNA 的合成 利用Trizol 法（Trizol Reagent，Invitrogen）提取實(shí)驗(yàn)鵝腿肌組織的總RNA。以1% 瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 的純度和濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA 的合成利用5X All-In-One RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Abm，Canada）。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，RNA 1 ng，Nuclease-free H2O 加到20 μL。反應(yīng)條件為25℃10 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 保存。反應(yīng)完成后取出加40 μL dd H2O 稀釋，-20℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 公布的mRNA 序列，采用Primer Premier 5.0 軟件對(duì)肌肉特異性相關(guān)基因以及內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1、2）。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 鵝肌肉特異性基因PCR 擴(kuò)增引物

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 模板，加入已驗(yàn)證好的引物，根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。反應(yīng)體系10 μL：2×S6 Universal SYBR qPCR Mix5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL；qPCR 程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)，取平均值。

表2 鼠肌肉特異性基因PCR 擴(kuò)增引物

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 本次實(shí)驗(yàn)以GAPDH 基因作為內(nèi)參基因?qū)z測(cè)的目的基因進(jìn)行歸一化，采用 2-ΔΔCt法得出不同光照時(shí)間下浙東白鵝肌肉特異性基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。差異顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同光照對(duì)體重和褪黑素含量的影響 如圖1 所示，長(zhǎng)光照組的平均體重為3.86 kg，較短光照組下降了14.41%（P＜0.05）。短光照組體內(nèi)血清的褪黑素含量（431.29 ng/L）較長(zhǎng)光照組（377.94 ng/L）顯著提高。

圖1 2 種光照制度下浙東白鵝的平均體重和血清內(nèi)的褪黑素含量

2.2 光照對(duì)鵝肌肉特異性基因表達(dá)的影響 RT-qPCR 結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)期間，所有基因的表達(dá)水平都發(fā)生了變化。由圖2 可知，短光照組中Pax7、Pax3、Myf6、MSTN基因表達(dá)高于長(zhǎng)光照組（P＞0.05），其中Myf5基因的表達(dá)高于長(zhǎng)光照組（P＜0.05）。而長(zhǎng)光照組中MyoG、MyoD基因的表達(dá)高于短光照組（P＞0.05）。

圖2 2 種光照制度下浙東白鵝肌肉特異性基因mRNA 的表達(dá)

2.3 不同MLT 濃度處理C2C12 細(xì)胞后肌肉特異性基因的表達(dá) 圖3 結(jié)果顯示，Myf5基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達(dá)低于0 ng/mL 組（P＜0.01），而且Myf6基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達(dá)低于0 ng/mL 組（P＜0.05），其他基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達(dá)雖然沒(méi)有顯著差異，但都呈下降趨勢(shì)。相反，各個(gè)基因在0.1、1 ng/mL 處理組的表達(dá)與0 ng/mL 組均無(wú)顯著變化。2.4 C2C12 細(xì)胞的培養(yǎng) 圖4 顯示的是細(xì)胞融合度達(dá)到30%、50%、70%、90%的10 ng/mL MLT 處理組和0 ng/mL MLT 處理組的細(xì)胞形態(tài)。圖中可以看出，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70% 或90% 時(shí)，10 ng/mL MLT 處理組的細(xì)胞形態(tài)比0 ng/mL MLT 處理組的更為纖長(zhǎng)。

圖3 不同濃度處理下小鼠成肌細(xì)胞C2C12 中特異性基因的表達(dá)

圖4 C2C12 細(xì)胞的增殖過(guò)程

2.5 10 ng/mL MLT 處理C2C12 細(xì)胞后肌肉特異性基因的表達(dá)譜 從圖5 可以看出，細(xì)胞融合度達(dá)到30%、50%、70%、90% 時(shí)肌肉發(fā)育基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達(dá)都低于0 ng/mL MLT 處理組（P＞0.05），結(jié)果表明在一定條件下，10 ng/mL MLT 處理對(duì)C2C12細(xì)胞中的肌肉特異性基因有抑制作用。

圖5 10 ng/mL MLT 處理C2C12 細(xì)胞后肌肉特異性基因的表達(dá)譜

3 討論

3.1 光照對(duì)浙東白鵝體重的影響 家禽的眼睛對(duì)光非常敏感，光照是影響家禽生產(chǎn)力表現(xiàn)的主要環(huán)境因素之一，而體增重是評(píng)定家禽生產(chǎn)性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中短光照組的平均體重顯著高于長(zhǎng)光照組，與前人的試驗(yàn)結(jié)果不同。如王秋菊等[4]試驗(yàn)表明，長(zhǎng)日照對(duì)東北白鵝公鵝總增重沒(méi)有顯著影響，但對(duì)東北白鵝和浙東白鵝的總增重有顯著的促進(jìn)增長(zhǎng)作用。Schwean-Lardner 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，23 h 光照飼養(yǎng)下肉雞的體增重小于17 h 光照飼養(yǎng)下的肉雞體增重，說(shuō)明延長(zhǎng)光照時(shí)間不一定促進(jìn)家禽生長(zhǎng)。也有研究發(fā)現(xiàn)不同光照時(shí)間不會(huì)影響家禽體重。石雷等[6]研究證實(shí)，4 種光照節(jié)律下的肉雞平均體增重?zé)o顯著差異，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的光照使肉雞興奮性增強(qiáng)，加大活動(dòng)力度，從而導(dǎo)致體增重的差異。另外，不同的研究學(xué)者采取的試驗(yàn)條件不同，包括品種、光照時(shí)間和恒定光強(qiáng)度的選擇，以及季節(jié)導(dǎo)致的溫度差異均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。研究表明，不同雞種體重存在顯著差異，其肌肉中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞大小也有顯著差異，且骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化也有顯著差異[7]。

3.2 褪黑素、光照對(duì)浙東白鵝肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的影響 從上述結(jié)果可以看出，長(zhǎng)光照組的平均體重和血清中MLT 含量均顯著低于短光照組，表明光照對(duì)浙東白鵝的體重和體內(nèi)MLT 含量有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)松果體能將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為褪黑素信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的免疫、激素的合成以及生殖等生理活動(dòng)，并且光周期、光強(qiáng)度和光波長(zhǎng)均能影響家禽MLT 的分泌[8]。Calvo-Guirado 等[9]研究表明，MLT 可以促進(jìn)大鼠脛骨植入中新骨的生長(zhǎng)。Natalia 等[10]研究表明，添加10～100 ng/mL MLT 可以促進(jìn)雞胚原代衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。以上數(shù)據(jù)表明，MLT 對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響。

3.3 光照對(duì)浙東白鵝肌肉特異性基因表達(dá)的影響MRFs 包 括Myf5、MyoD、Myf6或MRF4和MyoG，其中Myf5和MyoD主要參與成肌細(xì)胞的增殖；MyoG在胎兒發(fā)育中起作用，并且主要在分化末期表達(dá)；而Myf6主要在出生后表達(dá)，參與肌細(xì)胞的最終分化及肌纖維的維持。Pax3和Pax7同屬于Pax基因家族的第三亞家族，是生肌過(guò)程中主要的上游調(diào)控因子。Pax3主要調(diào)控早期胚胎的肌發(fā)生，而Pax7主要與肌肉損傷的修復(fù)有關(guān)，在這兩個(gè)過(guò)程中另一方扮演輔助角色。肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）為T(mén)GF-β超家族成員，對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。成年家畜的肌肉生長(zhǎng)能力在胚胎時(shí)期就已決定[11]。但這些生肌決定因子的相關(guān)機(jī)制仍未不清楚。

肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育受上述因子調(diào)控，同時(shí)這些因子也存在廣泛的相關(guān)性。陳禧[12]研究發(fā)現(xiàn)，在出生后母鴨胸肌中，Pax3、Pax7、MyoD和Myf5具有廣泛的相關(guān)性，幾乎任意兩基因的表達(dá)水平均呈顯著或極顯著相關(guān)。Pax7基因與Pax3基因相互作用，通過(guò)誘導(dǎo)MyoD和Myf5基因的表達(dá)來(lái)參與骨骼肌的發(fā)育[13]。研究表明，MyoD和Myf5之間可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Myf5促進(jìn)MyoD基因的表達(dá)，而MyoD又抑制Myf5基因的表達(dá)[14]。在MyoG缺失的動(dòng)物肌肉中Myf6 水平顯著增加，這在一定程度上具有代償作用[15]。因此本試驗(yàn)中肌肉特異性基因表達(dá)的變化結(jié)果應(yīng)該結(jié)合起來(lái)分析，長(zhǎng)光照組中Myf5基因的表達(dá)顯著降低，而MyoD的表達(dá)在長(zhǎng)光照組有上升趨勢(shì)但并不顯著，與前人結(jié)果類似[14]。而且Myf6基因的表達(dá)在長(zhǎng)光照組有下降趨勢(shì)，MyoG基因在長(zhǎng)光照組有上升趨勢(shì)，本試驗(yàn)推測(cè)兩者之間可能存在代償作用。目前關(guān)于肌肉特異性基因功能的研究尚不清楚，還需要進(jìn)一步探索。

骨骼肌快肌和慢肌的上游調(diào)節(jié)因子Pax7和Pax3是重要的肌源性誘導(dǎo)物，在骨骼肌的發(fā)展和更新過(guò)程中起重要作用。Pax7基因是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。Pax7與肌肉的生長(zhǎng)和修復(fù)密切相關(guān)，在衛(wèi)星細(xì)胞的特化、增殖和激活過(guò)程中都有表達(dá)[16]。研究證實(shí)Pax3的持續(xù)表達(dá)可以抑制肌細(xì)胞分化，表明Pax3表達(dá)下降是成肌過(guò)程持續(xù)進(jìn)行的必要步驟[12]。Pax3對(duì)胚胎期動(dòng)物四肢的正常生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要，而Pax7更傾向于參與骨骼肌損傷修復(fù)的過(guò)程[17]。可能是因?yàn)镻ax7、Pax3分別在骨骼肌損傷修復(fù)和胚胎發(fā)育期起作用，在生長(zhǎng)后期兩者的表達(dá)會(huì)下調(diào)，因此本試驗(yàn)中Pax7、Pax3基因的表達(dá)并沒(méi)有受光照調(diào)控的趨勢(shì)。

研究發(fā)現(xiàn)Myf5在脊椎動(dòng)物的生肌過(guò)程中扮演重要角色[18]。其表達(dá)水平通常在孵化時(shí)最高，然后隨年齡增加而下降[19]。本試驗(yàn)中，長(zhǎng)光照組中Myf5基因的表達(dá)較短光照組顯著下調(diào)，表明光照對(duì)Myf5基因的表達(dá)有顯著影響。Myf6基因主要參與出生后肌肉分化的過(guò)程，并在成肌細(xì)胞的持續(xù)分化過(guò)程中起重要的調(diào)控作用，且在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中保持相對(duì)較高的表達(dá)水平[20]。本試驗(yàn)中，Myf6基因的表達(dá)相對(duì)其他基因呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，但長(zhǎng)光照組和短光照組的Myf6基因表達(dá)沒(méi)有顯著差異，可能是因?yàn)镸yf6基因的表達(dá)不受肌肉類型、年齡和品種的影響[21]。

MyoG在成肌細(xì)胞融合為肌纖維的過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，是肌細(xì)胞終末分化的關(guān)鍵因子。Patruno 等[22]研究了長(zhǎng)白豬在胚胎期高表達(dá)MyoG，出生后呈低表達(dá)的穩(wěn)定趨勢(shì)。需要考慮的是，在不同種類的動(dòng)物中，同種動(dòng)物的不同發(fā)育時(shí)期，同種動(dòng)物的不同類型的肌肉組織，同種細(xì)胞的不同狀態(tài)下MyoG基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)具有不同規(guī)律[23]。目前MyoG在禽類胚胎發(fā)育過(guò)程中肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)特性的研究比較少。本研究中長(zhǎng)光照組MyoG基因的表達(dá)略高于短光照組，但沒(méi)有顯著趨勢(shì)，鑒于MyoG基因在鵝早期增重發(fā)揮調(diào)控作用[24]，猜測(cè)MyoG基因在浙東白鵝產(chǎn)蛋期的表達(dá)水平可能已經(jīng)穩(wěn)定，并且不受光照影響。

MyoD能促進(jìn)各種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，是肌肉組織形成的調(diào)節(jié)決定因子。肌肉中MyoD與Myf5表達(dá)相似，都是先升高后降低[25]。MyoD基因的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制成肌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)成肌細(xì)胞分化為成熟的肌纖維細(xì)胞[26]。本試驗(yàn)中MyoD基因的表達(dá)在長(zhǎng)短光照組中均不顯著，表明此試驗(yàn)中MLT 對(duì)MyoD基因表達(dá)沒(méi)有影響。

MSTN是一種對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用的細(xì)胞因子，其突變或缺失會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞增生和肌纖維肥大[27]。研究報(bào)道，肌肉生長(zhǎng)性狀表現(xiàn)迥異的蛋雞和肉雞MSTNmRNA 表達(dá)量并無(wú)明顯差異，表明單一個(gè)MSTN基因不足以解釋禽類機(jī)體正常生長(zhǎng)過(guò)程中肌肉的生長(zhǎng)情況，而應(yīng)與其他基因結(jié)合分析[28]。研究發(fā)現(xiàn)，MRFs 家族不同成員在肌肉生長(zhǎng)時(shí)先后表達(dá)，促進(jìn)肌細(xì)胞增殖、分化，而MSTN可通過(guò)調(diào)控MRFs 抑制肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[29]。本試驗(yàn)中，MSTN基因的表達(dá)水平相對(duì)較低，MRFs 家族的成員表達(dá)水平較高，表明機(jī)體可能處于促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的趨勢(shì)。王錢(qián)保[30]研究證實(shí)，淮南麻黃雞的MSTN基因表達(dá)量與體重呈顯著負(fù)相關(guān)。Zhang 等[31]研究顯示，MSTN基因的多態(tài)性對(duì)邊雞6～18 周齡的體重有顯著影響。本試驗(yàn)中MSTN基因在長(zhǎng)光照組中的表達(dá)略低于短光照組，但無(wú)顯著差異，而長(zhǎng)光照組的體重顯著低于短光照組，說(shuō)明MSTN基因的表達(dá)與體重沒(méi)有顯著關(guān)系。

3.4 褪黑素對(duì)小鼠成肌細(xì)胞發(fā)育基因表達(dá)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL MLT 對(duì)C2C12 細(xì)胞中的肌肉特異性基因有抑制作用。有研究表明在C2C12 成肌細(xì)胞系中添加1～2 mmol/L 褪黑素能誘導(dǎo)自噬從而降低MyoD[32]。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在C2C12 細(xì)胞中添加MLT 并沒(méi)有顯著降低MyoD基因的表達(dá)水平，可能是因?yàn)闈舛炔灰唬蚴亲允蓪?dǎo)致的MyoD的下調(diào)所致。后續(xù)試驗(yàn)將利用浙東白鵝腿肌細(xì)胞進(jìn)行不同的MLT 濃度處理實(shí)驗(yàn)，并且在之前細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上再增加骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探測(cè)各個(gè)基因的相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)Myf5基因在長(zhǎng)光照組中呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，其他基因沒(méi)有顯著變化；C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加適宜濃度（10 ng/mL）的MLT 對(duì)肌肉特異性基因有抑制作用；Myf5基因在10 ng/mL MLT 組的表達(dá)極顯著低于0 ng/mL MLT 組，Myf5基因可能是光照通過(guò)褪黑素影響肌肉發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵基因，其他基因的作用需要進(jìn)一步研究。