不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌區系的比較分析

聶召龍，王 音，潘 浩，劉書杰，孫 璐，馮宇哲，張曉衛，崔占鴻*

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，青海西寧 810016；2.青海省牦牛工程技術研究中心，青海西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，青海西寧 810016）

牦牛是青藏高原及其鄰近地區的大型反芻動物，主要分布在海拔3 000 m 以上。目前我國牦牛約1 600 萬頭，占世界牦牛數量的95% 以上，主要分布在新疆、西藏、青海、甘肅、四川、云南等地[1-2]。青海省是我國最大的牦牛飼養大省，占全國牦牛總數的40%。牦牛可提供牛奶、肉及可制成織物的毛發[3-4]。對于牦牛而言，幼年期是從斷奶到性成熟（0.5～2 歲），牦犢牛從母乳喂養過渡到采食飼料，且采食量增加，消化能力增強。牦牛在2～4 歲時生長發育接近成熟，體型基本固定，絕對增重達到峰值。動物成年期是指從生理成熟到開始衰老（4～8 歲），成年牦牛組織器官發達，生理功能成熟，代謝水平穩定，生產性能最高，是利用牦牛的最佳時機[5]。

反芻動物以木質纖維素副產品為食，如谷物秸稈、樹葉和油籽餅。瘤胃中含有的復雜微生物群落對有效利用復雜的植物材料起關鍵作用[6]。瘤胃細菌對反芻動物的健康和飼料效率的提高至關重要，細菌組成結構會隨著年齡的變化而變化[7-8]。然而，牦牛瘤胃細菌區系隨年齡變化的動態尚不清楚。基于此，本研究采用16S rRNA測序技術分析不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌區系，為牦牛瘤胃微生態平衡的調控和飼養管理提供重要依據。

臨床上面對“鏡面人”這類罕見病例，外科醫生手術治療應站在內臟器官反位的角度去思考和操作，并精細分辨除臟器反位以外的解剖結構變異，積累經驗，提高診治能力。

1 材料與方法

1.1 動物分組、飼養管理和取樣 在青海省玉樹州歇武鎮的同一牧場中，從5 月齡、1.5 歲、2.5 歲和3.5 歲4組健康的雄性牦牛中，各選取體重相近的牦牛6 頭，其中5 月齡組、1.5 歲組、2.5 歲組和3.5 歲組的平均體重分別為（58.30±4.29）、（119.40±5.82）、（156.50±8.78）、（189.4±13.69）kg。5 月齡牦牛吃少量母乳，其他牦牛自由放牧，采食牧草。該區域位于東經96°53' 和北緯34°56'范圍內，平均海拔4 500 m，年平均溫度為-1.6℃。

通過觀察牦牛采食牧草的情況，采集天然牧草樣品。樣品送青海省畜牧獸醫科學院青海省高原牦牛工程技術研究中心實驗室進行營養成分分析，測得灰分含量5.32%（風干基礎），粗蛋白含量11.28%，粗脂肪3.66%，中性洗滌纖維42.70%，酸性洗滌纖維31.73%，鈣0.31%，磷0.17%，鈣/磷比為1.96。

上午人工擠奶，每頭母牦牛取3 個樣品，獲得約500 mL 牛奶用于化學分析。所有牛奶樣品在冰上保存約4 h，并在到達實驗室后立即進行分析，測得干物質含量為16.68%，粗蛋白質為4.71%，粗脂肪為5.25%，乳糖5.57%，全乳固體11.41%。

于2019 年9 月27 日—9 月30 日收集瘤胃液。禁食約8 h 后，牦牛被固定在限制槽中收集瘤胃液。然后將每頭牦牛的瘤胃液收集到2 個5 mL 的無菌凍存管中，投入液氮中下保存，提取DNA。

了解侍酒師工作的人都知道，常常一天12小時的高強度工作就已是個極大挑戰，但他卻在還一直堅持學習，并參加了國內外至少6場侍酒師比賽，拿了不下4個冠軍，直到2014年10月23日在“大中華侍酒師大賽”中拔得頭籌，才遂了這樁心愿。但與此同時，他似乎還干了很多不務正業的事情，比如說跑去教授WSET課程，比如說翻譯和撰稿。

除了時間狀語之外，說話者對歷史事件的追溯在時間層面上也發揮重要作用。盡管這類事件沒有出現具體時間節點，并且發生在遙遠的過去，但重大歷史事件往往會給人留下深刻印象。說話者往往會直接引用歷史事件并且省略具體時間，從而使得原本處于時間軸末端的實體向指示中心趨近。例如：

用通用引物V338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'）和V806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）對微生物基因組總DNA 的16S rRNA V3-V4 區進行PCR 擴增。PCR 反應體系（20 μL）：上、下引物（10 μmol/L）各0.8 μL，10 ng 模板DNA，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.4 μL Fastpfu 聚合酶和4 μL 5×Fastpfu 緩沖液，最后加ddH2O 至20 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30 個循環；將相同體積的1× 緩沖液（含SYBR Green I ）與PCR 產物混合，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。選擇條帶亮度在400～450 bp 的樣品進一步實驗。PCR產物以等密度比混合。然后，用德國橋根凝膠提取試劑盒對PCR 產物進行純化。在諾禾致源生物技術公司的Illumina MiSeq 平臺上對細菌擴增子進行測序。

根據樣本的唯一條形碼將單端讀取序列與樣本對比，并通過切斷條形碼和底漆序列來截斷。根據Cutadapt[9]質量控制過程，在特定的過濾條件下對原始讀數進行質量過濾，以獲得高質量的干凈讀數。使用UCHIME 算法（UCHIME Algorithm）[10]將讀取的數據與參考數據庫（Silva Database）[11]進行比較，以檢測嵌合體序列，然后去除嵌合體序列[12]。最后得到讀數。

1.3 序列及多樣性分析 基因序列文庫使用離子加片段庫工具包48 rxns（Thermo Scientific）生成，建庫質量采用Qubit@2.0 熒光計（Thermo Scientific）評估。最后，在離子S5TM XL 平臺上對該文庫進行測序，得到400 bp/600 bp 的單端讀數。

“花兒”，亦稱“少年”，因歌詞中將青年女子比喻為“花兒”而得名。它是主要流行于甘、青、寧、新四省區的一種民歌，深受漢、回、藏、土、東鄉、保安、撒拉、裕固八個民族人民的喜愛，唱詞浩繁，文學藝術價值極高，被稱為“西北之魂”[1]。2006年，“花兒”被確定為首批國家級非物質文化遺產保護項目，2009年又列入了世界非物質文化遺產保護名錄[2]。要讓“花兒”的民俗文化走出去，翻譯是關鍵；要做好翻譯，首先應該厘定“花兒”英譯的本質屬性，然后依據其本質屬性提出科學合理的英譯模式、策略與方法。

應用α多樣性方法，通過Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Good-coverage 6個指標分析樣本物種多樣性的復雜性。這些指標都是用QIIME（1.7.0 版）計算，并用R 軟件顯示。

用β多樣性分析評價物種復雜度的差異，用QIIME軟件（1.7.0 版）計算加權和未加權Unifrac 的β多樣性。在聚類分析之前先進行主成分分析（PCA），在R 軟件（版本2.15.3）中使用FactoMineR 包和ggplot2 包降低原始變量的維數。通過主坐標分析（PCoA）從復雜的多維數據中獲取主坐標并可視化。將之前得到的樣本間加權或未加權均勻度的距離矩陣變換為一組新的正交軸，通過這些正交軸，第一主坐標表示最大變異系數，第二主坐標表示第二最大變異系數，依此類推。PCoA分析由R 軟件（2.15.3 版）中的WGCNA 包、stat 包和ggplot2 包顯示。采用算術平均聚類法（UPGMA）對距離矩陣進行層次聚類，并用QIIME 軟件（1.7.0 版）進行聚類分析。

2.4 不同年齡牦牛瘤胃細菌的聚類差異分析 PCoA 結果（圖6）顯示，3.5 歲組與5 月齡組的細菌群落有明顯差異，PC1 差異占總變異的27.45%，PC2 差異占總變異的26.88%。此外，瘤胃細菌群落隨著年齡的增加而逐漸變化，5 月齡組和3.5 歲組幾乎成為2 個不同的群落。

1.2 DNA 提取與PCR 擴增 冷凍樣品在冰上解凍，在渦流混合器中均勻混合。用CTAB/SDS 法提取樣品總基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上監測DNA 濃度和純度。根據濃度，用ddH2O 稀釋DNA 至1 ng/μL。

1.5 統計分析 數據采用Excel 進行初步整理，并用SPSS 20.0 軟件進行數據獨立性、正態性和方差齊性檢驗，滿足方差分析條件后，進行ANOVA 單因素方差分析，差異顯著時用Duncan's 法進行多重比較，以P＜0.05 為差異顯著的判斷標準。數據結果為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同年齡牦牛瘤胃細菌Mothur 與Alpha 多樣性分析結果 總體而言，在3% 的距離上，從24 個不同的樣本總共獲得3 236 個OTU 中，每個樣本的平均OTU為1 816.38 個。此外，本報告共分析了24 個不同樣本的1 218 479 個有效序列。稀疏分析顯示了大量不同的樣品。具有97% 相似性的稀疏曲線也表明足夠的測序覆蓋率可以解釋每個樣本中的大多數細菌多樣性（圖1）。覆蓋指數大于99%表明微生物群落反映準確。此外，放牧牦牛年齡水平的增加對豐富度估計值（Ace 和Chao 1 指數）有顯著影響，而多樣性指數（Shannon 和Simpson 指數）的影響不顯著（表1）。

為了保證二期廠房及停車場的正常修建，在勘察的基礎上進行有針對性地開展邊坡治理工作十分必要且非常緊迫，并根據業主一致討論，把整個邊坡范圍作為本次治理范圍。

表1 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌的OTU 數目和Alpha 多樣性分析

圖1 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌稀疏曲線圖

2.2 不同年齡牦牛瘤胃細菌在門水平的優勢菌群分析 采用鑒定學分析方法，共檢測到26 個菌門。最豐富的菌門包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）、螺旋體門（Spirochaetes）（圖2）。5 月齡組和1.5 歲組以擬桿菌門（分別為55.94%和54.60%）、厚壁菌門（35.89% 和36.11%）、放線菌門（2.94%和3.31%）、螺旋體門（1.26%和1.53%）和變形菌門（Proteobacteria）（0.75%和0.86%）為主。2.5歲組和3.5 歲組則以擬桿菌門（49.31 和58.24%）、厚壁菌門（35.44 和27.65%）、放線菌門（5.54 和4.00%）、廣古菌門（2.57 和4.15%）和螺旋體門（1.84 和1.43%）最常見。與其他試驗組相比，3.5 歲組擬桿菌的相對豐度顯著增加，而厚壁菌的相對豐度則顯著降低。變形菌門在5 月齡組和1.5 歲組中含量高于2.5 歲組和3.5 歲組。不同年齡組瘤胃細菌群落在門水平上有明顯變化。4 個年齡組的厚壁菌門（P＜0.01）和擬桿菌門（P＜0.05）是優勢菌門，在不同年齡之間存在顯著差異。廣古菌門相對豐度隨年齡增長而呈線性增長（P＜0.01）。4 個年齡組其他各菌門均無顯著性差異。圖3 中列出了相對豐度前10 個細菌門。

圖2 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌門水平相對豐度圖

圖3 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌門水平熱圖

2.3 不同年齡牦牛瘤胃細菌在屬水平的優勢菌群分析在屬水平中，共檢測到212 個細菌屬。數據表明，最豐富的屬（相對豐度超過1%）可以闡明會影響瘤胃生態系統的最重要細菌（圖4）。在5 月齡組中，未分類-普雷沃氏菌屬（unidentified-Prevotellaceae）（豐度為4.33%）、未分類-瘤胃球菌屬（unidentified-Ruminoco ccaceae）（4.04%）、歐氏菌屬（Olsenella）（2.58%）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）（2.46%）、未分類-毛螺菌屬（unidentified-Lachnospiraceae）（2.45%）、未分類-韋榮氏球菌屬（unidentified-Veillonellaceae）（2.40%）、未分類-擬桿菌屬（unidentified-Bacteroidales）（2.26%）、未分類-理研菌屬（unidentified-Rikenellaceae）（1.80%）和奎因氏菌屬（Quinella）（1.49%）是優勢菌屬。在

序列分析采用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）[13]。相似性≥97% 的序列被分配給相同的OTU（操作分類單元）。對每個OTU 的代表序列進行篩選，以便進一步注釋。對每個有代表性的序列，Silva 數據庫[11]基于Mothur 算法用于注釋鑒定信息。為研究不同OTU 的系統發育關系，以及不同樣本（群）中優勢種的差異，利用MUSCLE 軟件（3.8.31 版）[14]進行了多序列比對。OTUs 豐度信息使用與序列最少的樣本對應的序列號標準進行歸一化。隨后的α多樣性和β多樣性分析均基于輸出的標準化數據進行。

圖4 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌屬水平相對豐度圖

2.5 不同年齡牦牛瘤胃細菌的代謝途徑和功能預測KEGG 水平1 被認為是KEGG 鑒定中的最高水平（圖7），其中鑒定代謝顯示出最高的相對豐度，在每組中超過總閱讀量的45%。KEGG 水平2 表明，瘤胃樣品中存在35 個基因家族（相對豐度＞0.08%）（圖8）。大多數基因屬于膜轉運（Membrane Transport）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、復制修復（Replication and Repair）、翻譯（Translation）、能量代謝（Energy Metabolism）和核苷酸代謝（Nucleotide Metabolism）。

同時，不同的年齡水平對甲烷桿菌屬（P＜0.01）、顫螺旋菌屬（P＜0.01）的相對豐度有顯著影響。圖5 列出了相對豐度前35 個細菌屬。根據沿X 軸聚類顯示，1.5歲、2.5 歲和3.5 歲組中的樣本聚集在一起，而不包括5月齡組。

(3)推進自動化監測技術，提高監測能力。自動化監測是地下水監測的發展趨勢，新建設的監測站點一般都安裝了自動化監測設備，提高了監測精度和頻率[13]。同時應該加快推進人工長期監測點的改建工作，提高自動化監測點比例，全面提升地下水自動監測能力和現代化水平。

圖5 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌屬水平熱圖

1.4 細菌代謝途徑與功能預測 Tax4Fun 功能預測是基于最小16S rRNA 序列相似性的最近鄰法，通過提取KEGG（京都基因與基因組百科全書）數據庫原核全基因組16S rRNA 基因序列，并使用BLASTN 算法（BLAST Bitscore＞1500）將其與SILVA SSU Ref NR 數據庫對齊來實現的建立相關矩陣，將UProC 和PAUDA 注釋的KEGG 數據庫的原核全基因組功能信息映射到SILVA數據庫，實現SILVA 數據庫功能注釋。利用SILVA 數據庫序列作為參考序列，將已測序的樣本從OTU 中聚類出來，獲得功能注釋信息。

圖6 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌的主坐標分析（PCoA）圖

1.5 歲組中，最豐富的序列是與未分類-普雷沃氏菌屬（5.36%）、瘤胃球菌屬（3.35%）、未分類-毛螺菌屬（3.33%）、未分類-韋榮氏球菌屬（3.16%）、歐氏菌屬（2.67%）、未分類-擬桿菌屬（2.46%）、奎因氏菌屬（2.31%）和理研菌屬（1.18%）有關的序列。在2.5 歲組中，最豐富的序列是未分類-普雷沃氏菌屬（5.61%）、歐氏菌屬（5.02%）、奎因氏菌屬（3.87%）、未分類-瘤胃球菌屬（3.44%）、未分類-毛螺菌屬（3.01%）、未分類-韋榮氏球菌屬（2.53%）、甲烷桿菌屬（Methanobrevibacter）（1.90%）、未分類的擬桿菌屬（1.75%）和未分類-理研菌屬（1.21%）。在3.5歲組中，最豐富的序列是未分類的擬桿菌屬（4.64%）、未分類-普雷沃氏菌屬（4.57%）、奎因氏菌屬（4.42%）、歐氏菌屬（3.56%）、甲烷桿菌屬（3.34%）、未分類-韋榮氏球菌屬（2.69%）、未分類-瘤胃球菌屬（2.21%）、未分類-毛螺菌屬（1.75%）和未分類-理研菌屬（1.46%）。

圖7 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌KEGG 水平1 功能預測

圖8 不同年齡放牧牦牛瘤胃細菌KEGG 水平2 功能預測

3.5歲組能量代謝（P＜0.01）、代謝（P＜0.05）、其他次生代謝產物的生物合成（P＜0.01）等功能基因的表達量高于5 月齡組，而細胞運動（P＜0.05）等功能基因的表達量低于5 月齡組（圖9）。3.5 歲組能量代謝（P＜0.01）、特征差（P＜0.05）、傳染病（P＜0.01）的功能基因表達量高于1.5 歲組（圖10）。3.5 歲組運輸和分解代謝（P＜0.05）、其他次生代謝產物的生物合成（P＜0.05）、細胞生長與死亡（P＜0.05）的功能基因表達量高于2.5 歲組（圖11）。

圖9 使用PICRUSt 測定的0.5 歲組和3.5 歲組的KEGG 路徑比較

圖10 使用PICRUSt 測定的1.5 歲組和3.5 歲組的KEGG 途徑比較

圖11 使用PICRUSt 測定的2.5 歲組和3.5 歲組的KEGG 途徑比較

3 討論

迄今為止，已有一部分研究對牦牛瘤胃微生物的分離培養進行了描述[15]，但不同年齡牦牛的瘤胃細菌區系仍不清楚。本研究采用16S rRNA 基因序列分析技術分析了不同年齡放牧牦牛瘤胃液中的菌群豐度和多樣性。瘤胃液樣本呈棕綠色，稍有黏性，有腐敗臭氣味。

Henderson 等[16]報道，DNA 有9 種提取方法，且均能滿足DNA 質量和數量的要求。因此，本研究采用CTAB/SDS 法從牦牛瘤胃液中提取DNA。本研究在瘤胃細菌種群中共檢測到3 236 個OTU，大于Xue 等[17]檢測到的507 個OTU。這些差異可能與每個文庫中有限的16S rRNA 基因克隆數目有關，因為隨著新物種的發現和最新技術或方法的出現，每個文庫中的16S rRNA 基因克隆數目不斷擴大。動物體內微生物群落的豐富性和多樣性隨著年齡的增長而增加[18-20]。本研究中，不同的年齡水平顯著影響豐富度，但多樣性指數的差異并不明顯。本研究中1.5 歲牦牛的瘤胃菌群的豐富度估計值（ACE 和Chao 1 指數）和多樣性指數（Shannon和Simpson 指數）均高于其他組，原因可能是斷奶后的

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圖9為欠壓補償前各變流器輸出電壓的仿真結果。由圖9可以看出,在沒有電壓補償且線路電阻不同的情況下,公共負荷或者本地負荷在0.8 s和1.6 s時波動,各變流器輸出電壓在365～375 V之間,系統不能在額定電壓下穩定運行。

1.5歲牦牛正處于生長發育的快速時期，胃腸道需要快速地消化吸收營養物質，瘤胃菌群更加活躍。

在哺乳動物中，微生物的分布受年齡、宿主、性別和基因型的影響[21-22]。擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃微生物群中最豐富的菌群。多數的擬桿菌被用來降解纖維，而大部分的厚壁菌被用來降解蛋白質和多糖[23]。此外，先前的研究表明，厚壁菌與擬桿菌的比例隨著年齡的變化而變化[24]。厚壁菌門和擬桿菌門存在一種相互促進的共生關系，它們共同促進宿主吸收或儲存能量，因此消化道內的擬桿菌和厚壁菌對發酵多糖非常重要，且兩者比例可能更為重要，擬桿菌門增加或厚壁菌門減少或擬桿菌門與厚壁菌門的比例增加都有助于促進宿主利用能量[24]。本研究中，3.5 歲牦牛瘤胃菌群中擬桿菌的相對豐度最高，厚壁菌的相對豐度最小，且在功能預測中，能量代謝的功能基因表達量都顯著高于其他年齡牦牛，表明3.5 歲牦牛能量利用率最好。

在屬水平上，普雷沃氏菌屬、毛螺菌屬和瘤胃球菌屬普遍存在于牛瘤胃的核心微生物群中[25-26]。然而，本研究中，牦牛的瘤胃中未分類的擬桿菌屬相對豐度最高，且3.5 歲牦牛高于其他年齡組。擬桿菌屬是產生短鏈脂肪酸的重要菌群[27-28]，在維持腸道菌群結構平衡方面發揮重要作用[29]。普雷沃氏菌屬有很多種類，它們主要參與糖類與蛋白質的降解[30]。有研究表明，飼喂精料會使瘤胃中普雷沃氏菌屬有上升的趨勢[31]。馬力等[32]報道，不同物候期牦牛瘤胃中的普雷沃氏菌屬的相對豐度為14.38%～17.03%，本研究中放牧牦牛瘤胃中的普雷沃氏菌屬相對豐度偏低。可能是由于本研究的牦牛都是處于自由放牧條件下，只采食天然牧草所致。本研究中，不同年齡放牧牦牛之間，顫螺菌屬差異較大。顫螺菌屬可利用宿主糖原作為能量來源，在炎癥病人體內，顫螺菌屬數量會顯著降低，由顫螺菌屬與體質指數和炎癥反應的負相關性推測它可能產丁酸鹽[33]。細菌定植始于出生，在宿主生長和免疫發育中起著重要作用[34-35]。一個穩定的微生物群落保護宿主免受侵入性病原體的侵害[36]，建立穩定的細菌群落在誘導穩態機制方面具有重要作用[37]。斷奶對5 月齡牦牛的瘤胃微生物群落組成有很大影響，處于從母乳向以牧草為基礎日糧過渡的階段，瘤胃的消化吸收功能也處于轉化和建立的過程中，瘤胃的免疫功能尚不健全，需要更多的具有免疫功能的菌屬來維持瘤胃健康。另外，本研究在牦牛瘤胃中發現了大量未經鑒定和培養的菌屬。這表明牦牛可能有一個更多樣的瘤胃細菌區系，但只有一小部分已被檢測到。

4 結論

本試驗結果表明，瘤胃細菌的組成與年齡和飲食相關的生理變化有關。5 月齡牦牛瘤胃中與健康免疫相關的菌群最豐富；1.5 歲牦牛處于生長發育的快速期，瘤胃菌群的豐富度與多樣性最高；3.5 歲牦牛與其他年齡牦牛相比，瘤胃的能量代謝功能最好。