基于高效液相色譜技術的本科創新實驗設計與實踐

胡鶯 孫姣霞 劉雪蓮 潘瑾

摘?要：依托教師科研項目，以典型環境內分泌干擾物雙酚A（Bisphenol?A，BPA）為實驗對象，基于高效液相色譜技術設計并開展創新實驗，引導學生自主思考及實驗探索，從分散液液微萃取前處理及高效液相色譜儀器分析兩大方面，摸索并優化各項參數條件，建立高效、便捷的檢測方法用于定量分析水樣中BPA。創新實驗設計結合了新穎的科研內容，激發學生主動探索的興趣，不僅強化了學生的基本實驗技能，而且培養和提升了學生的科研思維及綜合運用知識的能力。

關鍵詞：創新實驗;實驗教學;高效液相色譜

2016?年召開的全國科技創新大會提出，我國要在2030?年進入創新型國家前列，2050?年成為創新強國。實驗室是高等學校實施素質教育、培養學生創新精神與實踐能力的重要基地[1]，但常規的學生實驗教學往往不能充分培養學生的創新能力。在當前國家大力推進大眾創新創業的背景下，開設創新實驗項目是高校培養學生協作能力、科研能力、創新能力以及綜合素質的重要環節[2]。同時，教學和科研相輔相成，基于科研過程和科研成果的創新實驗教學更有助于激發學生對知識的探索欲，加深學生對專業學科領域的認識，強化學生的創新意識，提升學生的創新思維[3]。促進科研與教學互動，把科研成果轉化為實驗教學內容，使實驗教學從傳統的“知識傳授”轉變為“知識、能力、思維、素質”綜合素質培養，對推動大學生參與科學研究、營造良好的學術氛圍、培養學生的創新精神具有深遠意義，具有廣闊的發展空間。

1?創新實驗的設計背景及意義

合適的實驗項目是創新實驗開展的重要基礎，創新實驗設計結合新穎的科研內容，教學內容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起學生主動探索未知的興趣，并有利于培養學生的創新能力和綜合素質，實現學生?“高分高能”的培養目標[4]。

BPA在工業上常被用來合成環氧樹脂和聚碳酸醋等材料，從塑料袋、塑料飯盒、礦泉水瓶等日常用品，到醫療器械、食品包裝的內襯等，生活中到處都有BPA的身影。BPA的大量生產和使用使它不斷轉移至環境，且大量研究已證明即便在極低劑量（ng/L）的存在下，BPA也能干擾人體及動物正常的內分泌系統，從而影響生殖功能，導致惡性腫瘤的產生等一系列嚴重損害，甚至具有遺傳效應[5]。然而，在對環境樣品中痕量的?BPA?進行分析的過程中，往往由于BPA的濃度較低甚至是微量、基質組成復雜而被干擾，常規檢測方法達不到檢測要求。因此，高效、靈敏、便捷的檢測方法是開展BPA環境行為研究的基礎和保障，同時，環境樣品中BPA有效分離和富集的前處理至關重要。

分散液液微萃取（Dispersive??liquid-liquid??microextraction，DLLME）技術作為一種新型的樣品前處理手段，自Rezaee?等人于?2006?年首次提出以來迅速成為研究熱點[6]。Leong等在此基礎上建立了上浮溶劑固化分散液液微萃取技術（DLLME-SFO），采取低密度有機萃取劑，并在萃取離心后結合冷凍固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO進一步簡化了操作，具有樣品需求量小、有機溶劑用量少、操作簡便、萃取時間短、環境友好等突出[7]。本創新實驗結合分散液液微萃取上浮溶劑固化（DLLME-SFO）的樣品前處理方法和高效液相色譜法（HPLC）定量分析技術的聯用，指導學生全程參與實驗的各個環節，設計并優化樣品前處理及HPLC儀器分析的各項參數，建立快捷高效的水樣BPA檢測方法。教師全程指導，學生全程參與實驗設計及開展，全方位培養學生的“知識、能力、思維、素質”。同時，注重培養學生掌握文獻查閱和Word、Excel等文本編輯方法，以及SPSS、ORIGIN等數據統計分析軟件的使用，學習科研論文的基本組成和撰寫。

2?實驗原理及核心內容

本創新實驗的核心內容是從兩個方面進行參數優化確定：其一是BPA定量分析的HPLC儀器檢測條件;另一方面是樣品的DLLME-SFO前處理條件。

基于環境介質的復雜性以及環境樣品中BPA濃度通常較低的特點，通過樣品前處理需要達到分離和富集的目的，將BPA從樣品中分離出來并去除基體干擾，同時還要達到一定程度的富集效果以滿足后續定量檢測方法的檢出濃度。在進行樣品中BPA檢測的DLLME-SFO前處理條件優化時，主要通過富集倍數（Extraction?Factor，EF）和萃取回收率（Extraction?Recovery，ER）兩項指標進行萃取效果的考察和比較[8]，進而確定優化的萃取條件。

EF為上浮萃取相中BPA的濃度與水樣中BPA濃度的比值，Cfloated為萃取所得上浮相中BPA的濃度，C0為水樣中BPA的濃度。

萃取回收率ER（%）為萃取相中BPA的量占水樣中BPA量的百分比例，Mfloated為上浮萃取相中BPA的質量，M0為水樣中BPA的質量。Vfloated和V0分別為萃取相的體積和水樣體積。

樣品經過DLLME-SFO前處理，其中的BPA分離富集至萃取相，并經由離心冷凍后取出，所得到的萃取相融化后即可進一步結合檢測儀器進行定量分析。與氣相色譜（GC）和氣相色譜/質譜（GC/MS）等相比，高效液相色譜（HPLC）具有操作方便、測定時間短等優勢。在確定BPA檢測的HPLC色譜條件時，需重點考察并確定流動相的種類及流量、檢測波長、柱溫、進樣量等參數;并建立優化條件下BPA測定的標準曲線，用于BPA的定量分析。

最后，還需對實驗所建立的DLLME-SFO-HPLC檢測方法進行評價。采用逐步稀釋法結合高效液相色譜工作站，確定方法的檢出限和定量限。結合加標回收實驗，分析加標回收率和相對標準偏差。從方法的線性范圍、檢出限、實際樣品加標回收率等方面進行所建檢測方法的綜合評價。