滇重樓及其近緣種的表型變異與資源評價

王元忠 沈濤 張金渝

摘? 要：以滇重樓及其近緣種為對象，通過表型性狀調查結合多元統計分析，研究重樓屬藥用植物的表型變異及各性狀對藥材產量的影響。結果顯示：16個表型性狀中，株高、莖粗、葉形、葉寬、葉柄長等性狀變異較大（CV值大于40.00%），萼片長、萼片數、花瓣數種間變異較小（CV值均小于25.00%）。5種重樓屬植物表型性狀的遺傳多樣性指數（H）為2.03～0.82;滇重樓和多葉重樓性狀的遺傳多樣性指數平均值最高。主成分分析結合偏最小二乘-判別分析顯示，多葉重樓、滇重樓的葉部和花部位性狀與其他物種差異較大;南重樓和西疇重樓的株高、莖粗、葉寬、根莖長、根莖直徑、根莖鮮重與其他重樓屬物種差異明顯;5種重樓屬植物中南重樓與西疇重樓形態最接近，較難區分。相關性分析表明，重樓屬植物地上性狀與地下性狀呈顯著或極顯著的正相關（P<0.05或P<0.01）;進一步利用變量投影重要性指標分析發現，根莖直徑、根莖長、葉柄長、葉長、葉寬、花梗長、株高和花瓣長是篩選藥用重樓高產種源的關鍵性狀。

關鍵詞：滇重樓;近緣種;表型變異;遺傳多樣性;資源評價

中圖分類號：S567????? 文獻標識碼：A

Phenotypic Variation and Resource Evaluation of Paris polyphylla var. yunnanensis and Its Relative Species

WANG Yuanzhong1， SHEN Tao2， ZHANG Jinyu

1. Medicinal Plants Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan 650200， China; 2. College of Chemistry， Biology and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi， Yunnan 653100， China

Abstract： In the present study， the phenotypic characteristics of Paris polyphylla var. yunnanensis and its relative species were investigated and analyzed. The variations of the phenotypic traits were studied through the investigation of traits and multiple statistical analyses. The plant height， stem diameter， leaf shape index， leaf width， petiole length， and traits had high values of interspecies variation coefficient （CV > 40.00%）. Meanwhile， the traits of flowers， such as calyx length and calyx width， had lower CV value （< 25.00%）. Genetic diversity indexes （H'） was ranged from 2.03 to 0.82. Paris polyphylla var. yunnanensis and P. polyphylla had the highest mean value of H' in the five species. The principal component analysis combined with Partial least squares-discrimination analysis showed the phenotype of leaf and flower were the key traits for discrimination between P. polyphylla and Paris polyphylla var. yunnanensis. Compared P. vietnamensis and P. cronquistii var. xichouensis with the other three species， plant height， stem diameter， leaf width， rhizome length， rhizome diameter， and rhizome fresh weight were different. The samples of P. vietnamensis， and P. cronquistii var. xichouensi were hard to distinguish from each other. Correlation analysis found that overground traits were significantly positively correlated with underground traits （P < 0.05 or P < 0.01）. Combined with VIP analysis， it could be found that rhizome diameter， rhizome length， petiole length， leaf length， leaf width， pedicel length， plant height， and petal length were key traits for selecting germplasm resources of high-yielding medicinal Paris species.

Keywords： Paris polyphylla var. yunnanensis; relative species; phenotypic variation; genetic diversity; resource evaluation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.013

滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）隸屬百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris L.），是云南具有地域特色的藥用植物，與同屬植物七葉一枝花（P. polyphylla var. chinensis）被《中國藥典》2020版收錄作為傳統名貴藥材重樓的主要基源植物[1]。滇重樓干燥根莖具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是“云南白藥”“宮血寧膠囊”“季德勝蛇藥片”等80余種中成藥的主要原料[2]。隨著工業化生產需求增加，滇重樓野生資源遭到人為過度采挖，瀕臨滅絕，其替代藥源的開發與資源評價迫在眉睫[2-3]。

南重樓（P. vietnamensis）、西疇重樓（P. cronquistii var. xichouensis）、多葉重樓（P. polyphylla）等重樓屬植物的藥用價值已受到學者廣泛關注。趙飛亞等[4]利用超高效液相色譜（UPLC）技術對10種重樓化學成分進行定量分析，認為多葉重樓質量優于《中國藥典》收錄品種，而南重樓與滇重樓質量相近。Wang等[5]基于重樓皂苷（polyphyllin）Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ及纖細薯蕷皂苷（gracillin）定量分析結果，發現西疇重樓藥效成分含量較高的，可作為滇重樓的替代藥源。楊遠貴等[6]對重樓屬植物化學成分與藥理活性進行綜述報道，表明該屬大部分物種具有藥用價值，藥用資源開發潛力巨大。

表型性狀是生物資源評價與種質篩選的基礎，也是衡量物種多樣性的重要指標。對藥用植物表型性狀的遺傳多樣性進行評價，有助于后續藥材優異基因挖掘、品種選育改良[7-9]。重樓屬植物形態變異大，種間甚至同種不同種群間的性狀特征常有交叉重疊，不同文獻記載的重要性狀和分類觀點不統一，阻礙著該屬藥用資源的正確認識及客觀評價[10-11]。除種源鑒別問題，王騫等[12]研究發現表型性狀可能影響藥材質量，葉長、葉形指數等性狀與重樓藥用部位藥效成分含量呈現

正相關關系。重樓藥材生產過程中，亟待尋找表現直觀、易于識別、與生產直接相關的植物性狀，以協助藥用重樓種源鑒別與良種篩選[13-14]。

目前，藥用重樓表型變異及相關資源評價主要集中于滇重樓[14-15]，其他重樓屬植物報道較少[16-17]。本研究選取‘滇重樓‘七葉一枝花‘南重樓‘西疇重樓和‘多葉重樓為研究對象，結合植物形態學、數量分類學的理論與方法，研究5種重樓屬植物表型性狀種間變異及其多樣性，探討表型性狀對藥源鑒別和優質高產種源篩選的實際意義，研究以期為滇重樓及其近緣種的鑒別與資源評價提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

分別從中國云南、廣西及越南高平省收集‘滇重樓‘七葉一枝花‘南重樓‘西疇重樓和‘多葉重樓5種重樓屬植物6個種群的野生資源，每個種群選取生長5 a左右的植株根莖，播種于資源圃相同遮陰棚內。遮陰棚的遮光度為50%，播種株行距10 cm×15 cm，種植過程中，不施肥，統一除草和澆水管理。在花期統一采收植株并測定農藝性狀。實驗樣品信息詳見表1。

實驗地點位于云南省農業科學院藥用植物研究所種質資源圃內，經緯度為102.98°E，25.18°N;海拔為1985 m，栽培土壤為紅壤，氣候帶類型為北亞熱帶，年平均溫度14～16 ℃，年平均最高溫度30～32 ℃，年平均最低溫度–5～–2 ℃，年均降水量900～1000 mm，年日照時數2108 h，植物生長期為220～280 d。

1.2? 方法

1.2.1? 形態指標的測定? 選取16個與藥材品質相關的表型性狀進行測定[9， 14]。地上性狀包括株高、莖粗、葉片數、葉長、葉寬、葉形指數、葉柄長、花梗長、萼片數、萼片長、萼片寬、花瓣數、花瓣長;地下性狀包括根莖長、根莖直徑、根莖鮮重。以上性狀每一種群測定株數見表 每一植株的每個性狀重復測定3次，取平均值。株高、葉長、葉寬、葉柄長、花梗長、根莖長采用直尺測量;莖粗、萼片長、萼片寬、花瓣長和根莖直徑采用游標卡尺測量。根莖鮮重用感量0.01 g電子天平稱重。

1.2.2? 數據處理? 表型性狀的平均值、標準差、變異系數及遺傳多樣性指數用Excel計算，單因素方差分析、相關性分析用SPSS 20.0計算;PCA、PLS-DA、PLS-R和VIP分析用SIMCA 14.1完成。

單因素方差分析（one-way ANOVA）和scheffé test用于比較5種重樓屬植物表型性狀的種間異性;變異系數（coefficient of variation， CV）用于評價滇重樓及其近緣種的表型變異程度;依據表型性狀平均值（Mean）和標準差（SD）計算遺傳多樣性指數（H=-∑PilinPi，Pi表示第i級的頻率）[18];主成分分析（principal component analysis， PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discrimination analysis， PLS-DA）用于重樓樣品的分類研究;相關性分析（pearson correlation analysis）初步研究各性狀間的相互關系，

利用偏最小二乘-回歸分析（partial least squares- discrimination analysis， PLS-R）構建表型性狀與藥材產量間的關系模型[19];變量投影重要性指標（variable projection importance indicator， VIP）用于篩選影響根莖產量的關鍵性狀[19]。

2? 結果與分析

2.1? 5種重樓屬植物的表型性狀比較

單因素方差分析顯示（表2），‘滇重樓花部萼片寬度、花瓣長度數值較高，與其他物種差異顯著（P<0.05）。‘南重樓和‘西疇重樓的葉長、葉寬、葉柄長、花梗長數值較高，‘多葉重樓中數值最低，呈顯著差異（P<0.05）。‘南重樓萼片長、花瓣長數值較高，與其他重樓屬植物有顯著差異（P<0.05）。‘滇重樓‘南重樓和‘西疇重樓葉片形狀較接近，葉形指數為1.99～2.20;‘七葉一枝花葉片狹長，葉形指數最高，葉形指數為（4.99±0.56）;‘多葉重樓葉片數目最多，七葉一枝花次之，其他重樓樣品間差異不顯著（P>0.05）。地下性狀中，‘西疇重樓根莖鮮重、根莖長和根莖直徑數值均最高，而‘多葉重樓地下各性狀數值均最低，二者差異顯著（P<0.05），其他重樓屬植物地下性狀差異未達顯著水平（P>0.05）。

2.2? 表型變異與遺傳多樣性分析

從表3可見，16個性狀中，株高、莖粗、葉形、葉寬、葉柄長、花梗長、花瓣長和根莖鮮重是種間變化較大的性狀，以上性狀CV值均大于40.00%。其中，地下性狀根莖鮮重CV值達92.69%;花部性狀萼片長、萼片數、花瓣數種間變化較小，CV值均小于25.00%;莖葉性狀中，葉片數變化較小（CV值為25.73%），其余性狀均有明顯變異。

遺傳多樣性指數計算顯示（表4），5種重樓屬植物16個性狀的遺傳多樣性指數為2.03～0.82，其中花梗長、根莖直徑在‘滇重樓中數值最大，分別為2.00和2.03;株高、葉寬及葉形指數在‘多葉重樓中也較高，數值分別為2.01、2.01和2.02;葉片數在‘滇重樓及‘西疇重樓中遺傳多樣性指數最低，數值分別為0.82和0.86;萼片數、花瓣數在‘七葉一枝花和‘西疇重樓中最低，數值均≤0.98。綜合比較發現，‘滇重樓和‘多葉重樓16個性狀的遺傳多樣性指數平均值最高;各性狀中，株高、葉形、花梗長、萼片長等表型變異式樣豐富，具有較高的遺傳多樣性。

2.3? 基于表型性狀的PCA與PLS-DA分析

以‘滇重樓‘七葉一枝花‘南重樓‘西疇重樓和‘多葉重樓的16個性狀為變量利用主成分分析對樣品間的分類與聚集趨勢進行初步探索。結果顯示（圖1A），基于表型數據大部分樣品依照其所屬類群進行劃分，‘七葉一枝花與‘滇重樓‘多葉重樓形態較為接近;‘多葉重樓及其變種與‘南重樓及‘西疇重樓在形態上差異較明顯，而‘南重樓和‘西疇重樓樣品間分離趨勢不明顯共同聚為另一類。結合主成分分析載荷圖發現（圖1B），葉片數、葉形指數、花瓣數、萼片數是區分‘多葉重樓與其他重樓屬植株的重要性狀;萼片寬、萼片長及花瓣長在區分‘滇重樓時貢獻較大;而‘南重樓與‘西疇重樓的莖粗、株高、葉寬、根莖長、根莖直徑、根莖鮮重、根莖長等性狀與其他重樓屬植物差異較明顯。

在PCA分析基礎上，采用有監督的偏最小二乘-判別分析建立5種重樓屬植物的分類模型。結果顯示（圖2A），藥用重樓樣品可被明顯的區分為4類，‘滇重樓聚為第1類;‘七葉一枝花‘多葉重樓分別聚為第2類和第3類，但兩個物種間有少量樣品難以區分;‘南重樓與‘西疇重樓最難區分，總體聚為第4類。為證明分類模型的有效性，對分類結果進行了200次置換重要性檢驗，結果顯示（圖2B），位于圖形左邊的R2Y和Q2Y均低于右側的R2Y和Q2Y值，且R2回歸線截距小于0. Q2回歸線截距小于0，表明模型預測結果未出現過擬合，分類結果較準確。

2.4? 性狀間的相關性分析

Pearson相關性分析顯示，‘滇重樓‘七葉一枝花和‘多葉重樓地上多個性狀數值變化與植株根莖長、根莖直徑呈顯著或極限顯著相關（P<0.05或P<0.01）。株高、莖粗數值的增加有助于上述3種重樓地下性狀數值的增長（P<0.05或P<0.01）;葉部性狀中，葉長、葉寬、葉片數與根莖鮮重和根莖直徑呈顯著正相關（P<0.05或P<0.01）;花部性狀中，‘滇重樓‘多葉重樓地下性狀與花梗長、花萼數、花瓣數等性狀呈顯著或極顯著正相關（P<0.05或P<0.01）。‘南重樓和‘西疇重樓地上性狀與地下性狀數值的相關性較弱，但葉柄長與根莖直徑、根莖鮮重呈顯著正相關（P<0.05）。

為進一步建立藥用重樓高產種源的快速篩選方法，將85份藥用重樓的株高、莖粗、葉片數等15個性狀作為自變量（X），樣品根莖部位鮮重為因變量（Y）進行偏最小二乘-回歸分析。結果顯示，回歸模型R2X（cum）為0.749，即模型對變量X的解釋能力為74.90%;R2Y（cum）為0.872，表明提取的主成分能解釋的因變量變異87.20%;Q2（cum）為0.813，大于0.50，顯示預測結果較理想。繪制VIP得分圖顯示（圖3A），根莖直徑、根莖長、葉柄長、葉寬、葉長、花梗長和株高共7個性狀的VIP值大于1.00，表明上述性狀對預測重樓根莖鮮重具有重要作用是篩選藥用重樓高產種源的關鍵性狀。

此外，利用‘滇重樓‘七葉一枝花‘多葉重樓及‘西疇重樓地上性狀與藥材根莖鮮重進行回歸分析發現，回歸模型R2X（cum）為0.64，R2Y（cum）為0.772，Q2（cum）為0.67 表明上述4種藥用重樓僅依據地上性狀也能對藥材產量進行預測。其中重要地上性狀排序依次為（VIP值大于0.80）：葉柄長>葉長>葉寬>花梗長>株高>莖粗>葉片數（圖3B）。

3? 討論

采用ISSR（inter simple sequence repeat）、RSAP（restriction site amplification polymorphism）、SCOT（start codon targeted polymorphism）等分子標記對多葉重樓、滇重樓、狹葉重樓（P. polyphylla var. stenophylla）、球藥隔重樓（P. fargesii var. fargesii）等物種的研究發現，該屬植物遺傳多樣性水平較高，種內和種間具有豐富的遺傳變異[20-23]。本實驗研究顯示，5種重樓屬植物16個性狀的遺傳多樣性指數為2.03～0.82，表型性狀種間呈現豐富多樣的變異式樣。根莖是重樓的入藥部位。‘滇重樓‘七葉一枝花‘西疇重樓和‘多葉重樓的研究發現，根莖鮮重種間變異達92.69%。豐富的性狀變異有助于后續栽培馴化及特異種質資源的發掘。

重樓屬種及種下形態分類較困難，如‘南重樓在云南文山西疇、紅河建水一帶形態與‘滇重樓較接近，而在瑞麗至西雙版納勐臘一帶與‘多葉重樓較接近[10]。李恒等[10]依據重樓屬植物形態特征及演化趨勢，將重樓分為2個亞屬，8個組，24個種。其中，‘滇重樓‘七葉一枝花‘多葉重樓‘西疇重樓和‘南重樓均屬側膜亞屬的植物，‘西疇重樓為凌云重樓的變種，‘南重樓為獨立種，‘滇重樓和‘七葉一枝花為多葉重樓的變種。Ji等[20]基于細胞核ITS序列和質體DNA序列數據對21種重樓屬植物進行分類研究，結果顯示，‘南重樓與‘西疇重樓親緣關系較接近，‘七葉一枝花與以上物種親緣關系較遠，與‘多葉重樓親緣關系更近。國內學者利用葉綠體matK基因和RSAP分子標記對重樓屬植物的遺傳關系進行研究，發現‘滇重樓‘七葉一枝花和‘多葉重樓可劃分為一類，并建議將‘滇重樓‘七葉一枝花作為多葉重樓的變形處理[21-22]。本研究基于16個表型性狀的PCA及PLS-DA分析顯示，‘西疇重樓和‘南重樓樣品多聚為一類;‘滇重樓‘七葉一枝花是多葉重樓的變種，3個物種各性狀的數量特征具有一定的相似性，但大部分樣品可以被區分。各性狀中，葉部和花部性狀是區分‘多葉重樓及其變種的關鍵性狀，而地下性狀在區分‘南重樓‘西疇重樓時貢獻較大。

植物性狀間常存在相互聯系，以上關系可輔助根莖類藥材地下性狀的篩選[24]。地黃（Rehmannia glutinosa）研究顯示，植株塊根鮮重與莖葉性狀相關性顯著，通過對冠幅、莖粗、葉片大小等性狀的選擇可提高地黃單株塊根產量[25]。高曉霞等[26]對不同品系黃芩（Scutellaria baicalensis）農藝性狀的相關性進行分析，發現蘆頭直徑與根鮮重存在極顯著的相關性，該結論可協助黃芩藥材的品種選育。‘滇重樓‘七葉一枝花及‘多葉重樓是目前栽培較多、經濟價值較高的藥用重樓，市場對高產優質種源需求迫切。然而實際生產中重樓根莖性狀在選育過程中難以直接觀測。5種重樓屬植物表型性狀相關性分析顯示，地上、地下多對性狀間存在正相關關系。‘滇重樓‘七葉一枝花‘多葉重樓地上性狀與地下根莖鮮重相關性較強，通過建立回歸模型，葉柄長、葉長、葉寬、花梗長、株高、莖粗和葉片數可間接預測地下藥用部位產量，今后研究可進一步增加樣本量完善預測模型，服務實際生產，提高種源的篩選效率，縮短篩選周期。

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責任編輯：黃東杰