不同有機肥施用量對反季節蓮霧園區土壤細菌群落的影響

吳斌 黃東梅 馬伏寧 王必尊 宋順 何應對 王麗霞 劉永霞

摘? 要：以海南蓮霧（Syzygium samarangense）為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術，比較分析不同有機肥施用量對反季節蓮霧園區土壤細菌群落多樣性的影響。結果表明：（1）共檢測到741 391條有效序列，32 778個OTU（operational taxonomic unit，操作分類單元），包含28門分類和418個屬分類，其中酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）為優勢群落;（2）土壤細菌群落多樣性和豐富度順序為BML（香蕉莖稈有機菌肥，低濃度，2 kg/株）=GML（羊糞有機肥，低濃度，2 kg/株）>GMM（羊糞有機肥，中濃度，4 kg/株）=BMH（香蕉莖稈有機菌肥，高濃度，6 kg/株）>CK（對照）>GMH（羊糞有機肥，高濃度，6 kg/株）=BMM（香蕉莖稈有機菌肥，中濃度，4 kg/株）;（3）線性判別分析（linear discriminant analysis effect size， LEfSe）發現不同施肥處理組（CK處理組、GM處理組、BM處理組）中有37個顯著差異的物種（5個綱，7個目，9個科，8個屬，8個種），與維恩圖的分析結果一致，即不同濃度的羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥處理下的細菌群落結構具有一定的相似性和差異性。研究表明，施用低濃度的羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥時，土壤細菌群落結構的多樣性顯著高于其他處理。因此，蓮霧反季節催花時，施用低濃度的有機肥不僅有利于提高土壤細菌群落的多樣性和穩定性，同時還可以減少有機肥施用量，達到精準施肥的目的。

關鍵詞：蓮霧;反季節催花;有機肥;細菌群落;Illumina MiSeq

中圖分類號：Q939.96????? 文獻標識碼：A

Effects of Different Organic Fertilizer Rates on the Bacterial Community of Off-season Syzygium samarangense Park Soil

WU Bin， HUANG Dongmei， MA Funing， WANG Bizun， SONG Shun， HE Yingdui， WANG Lixia，

LIU Yongxia*

Haikou Expenmental Station （Insttute of Tropical Fruit Tree Research）， Chinese Academy of Tropical Agnicultural Sciences / Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： The effects of different organic fertilizer rates on the bacterial community diversity of soil in the off-season Syzygium samarangense plantation were analyzed using the Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology. 741 391 effective sequences and 32 778 operational taxonomic units （OTU） were detected， including 28 phyla and 418 genera. Acidobacteria， Chloroflexi and Proteobacteria were the dominant soil bacterial communities under different fertilizers in S. samarangense plantation. The order of the soil bacterial communities diversity and richness was the BML （organic fungi-manure for banana stalks， low concentration， 2 kg per plant） = the GML （organic manure of sheep manure， low concentration， 2 kg per plant） > the GMM （organic manure of sheep manure， medium concentration， 4 kg per plant） = the BMH （organic fungi-manure for banana stalks， high concentration， 6 kg per plant） > the CK （Control） > the GMH （organic manure of sheep manure， high concentration， 6 kg per plant） = the BMM （organic fungi-manure for banana stalks， medium concentration， 4 kg per plant）. 37 significantly different species （5 classes， 7 orders， 9 families， 8 genera and 8 species） in the different fertilization treatment （CK treatment group， GM treatment group， BM treatment group） were found using the linear discriminant analysis effect size （LEfSe） analysis， which was consistent with the results from Venn， i.e.. The soil bacterial community structure was similar， but still had some differences under different concentrations of organic manure treatments. Moreover， the soil bacterial community diversity under low concentration of sheep and banana stalk manures was significantly higher than those of the other treatments. It indicates that low concentration of organic fertilizer could not only improve the soil bacteria diversity and soil bacterial community structure stability， but also save fertilizer use.

Keywords： Syzygium samarangense; promoting flowers of counter-season; organic fertilizer; soil bacterial community; Illumina MiSeq

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.039

蓮霧（Syzygium samarangense），又稱洋蒲桃，屬桃金娘科喬木，是著名的熱帶水果之一。蓮霧全年枝葉繁多，葉片凋落到地面形成較好的有機質來源，豐富了細菌群落的孕育。據不完全統計，自然環境下土壤微生物中的細菌群落可達106～ 109個/g，約占70%以上，由于細菌群落的大量存在，因此在維持土壤微生態中發揮著主要的作用[1-3]。細菌群落的多樣性和豐富度的增加，不僅有助于維持土壤微生態的穩定性[4-6]，同時還促進植物對營養元素的吸收。蓮霧在進行反季節催花時，為了提升產量和品質，通常以施用有機肥為主。但頻繁、過量施用有機肥會破壞土壤細菌群落的平衡[7-8]。因此，為了科學施用有機肥，達到精準施肥、提質增效的目的，開展不同類型有機肥及其施用濃度對蓮霧園區土壤細菌群落結構影響的研究具有重要意義。

目前，涉及細菌群落多樣性研究的主要方法是傳統培養方法與分子技術。由于自然界中超過99%的細菌無法進行人工培養或人工培養難以成活[9-10]，因此，基于傳統培養方法進行研究存在一定的局限性[11-13]。分子技術方法發展至今，對土壤細菌群落的多樣性進行研究分別有變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、末端限制性長度多態性（T-RFLP）、Sanger測序和焦磷酸測序等技術手段[14-15]。由于Illumina MiSeq高通量測序技術對數據量的測序深度較高，相對于其他分子方法能夠較全面地解析土壤細菌群落的情況。因此，本文基于Illumina MiSeq高通量測序技術，分析不同有機肥施用量對蓮霧園區土壤細菌群落多樣性的影響，為合理科學施用有機肥提供數據支持。

1? 材料與方法

1.1? 試驗處理

選取長勢一致的蓮霧，即將開展反季節催花時，進行如下處理：CK（不進行任何處理）、GML（羊糞有機肥，低濃度，2 kg/株）、GMM（羊糞有機肥，中濃度，4 kg/株）、GMH（羊糞有機肥，高濃度，6 kg/株）、BML（香蕉莖稈有機菌肥，低濃度，2 kg/株）、BMM（香蕉莖稈有機菌肥，中濃度，4 kg/株）、BMH（香蕉莖稈有機菌肥，高濃度，6 kg/株）。其中，羊糞有機肥中有機質≥35%，香蕉莖稈有機菌肥中N+P2O5+K2O≥5%、有機質≥45%、菌劑∶香蕉莖稈有機肥=1∶20。

1.2? 樣品采集

選取植株冠幅下距主干70～80 cm、深度10～15 cm處的土層進行樣品采集，每個處理隨機采集3～4個土樣，開展微生物總DNA的提取和土壤理化性質測定。

1.3? 土壤理化性質測定

參照《土壤理化分析與剖面描述》進行全氮（TN）、速效磷、速效鉀、有機質、pH等土壤理化性質的測定[16]。

1.4? 樣品總DNA提取

采用Power Soil? DNA Isolation Kit （MOBIO， USA）試劑盒，參照試劑盒使用說明書進行土壤微生物總DNA的提取和定性定量檢測。

1.5? PCR擴增及高通量測序

根據細菌16S rRNA V3-V4區保守序列合成338F/806R引物，以土壤微生物總DNA為模板，進行PCR擴增并回收PCR產物。委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.6? 數據處理

采用Excel 2016軟件進行前期處理，采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行多組樣本間差異顯著性分析（Duncan法）。采用QIIME進行OTU分析[17]，采用Mothur和UniFrac進行α多樣性分析[18-19]和β多樣性分析[20]，采用R語言等軟件進行維恩圖、熱圖和群落結構組分圖等分析。

2? 結果與分析

2.1? 蓮霧園區土壤理化性質

由表1可知，不同施肥處理下的蓮霧園區土壤，除含水量不存在顯著性差異外，全氮（TN）、速效磷、速效鉀、有機質含量及pH均存在顯著差異（P<0.05）。此外，不同類型和濃度的施肥處理可使土壤中速效磷和速效鉀的濃度顯著低于對照（P<0.05）。

2.2? 蓮霧園區土壤細菌群落OTU及多樣性分析

基于Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序，共獲得741 391條有效序列;聚類分析獲得32 778個OTU（表2）。分析不同施肥處理樣品獲得的稀釋曲線亦表明各個樣品的測序深度較高，稀釋曲線趨近于平坦（圖1），測序結果已具有代表性[21]，可進行下一步分析。

基于分析表征細菌豐富度的ACE指數、Chao1指數，以及指示細菌多樣性的Shannon- Wiener和Simpson指數可知，在羊糞有機肥GML和GMM處理后的土壤細菌群落多樣性和豐富度均高于對照，其中GML（低濃度羊糞有機肥）處理后細菌群落豐富度最高，但GMH處理低于對照;在香蕉莖稈有機菌肥處理下，雖然BML（低濃度香蕉莖稈有機菌肥）處理后細菌群落豐富度最高，與羊糞有機肥處理結果相似，但細菌群落豐富度最低的表現為BMM，且低于對照。

綜上所述，不同施肥處理下蓮霧園區土壤細菌群落多樣性和豐富度大小順序為：BML= GML>GMM=BMH>CK>GMH=BMM。由于BML和GML兩種處理均無顯著性差異，無法比較出BML和GML處理對蓮霧根際土壤細菌群落多樣性的影響程度。從整體上看，在低濃度（2 kg/株）處理下，羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥對蓮霧園區土壤細菌群落的影響顯著高于其他處理。

2.3? 蓮霧園區土壤細菌群落結構組成分析

通過Silva數據庫比對發現，樣品中的細菌群落包含28門分類（圖2A），所有土壤樣品中細菌群落結構的組成存在一定的相似性。其中，酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）占比最高，以上3種細菌群落約占土壤總細菌群落的73.47%～81.03%，在蓮霧園區細菌群落結構中起著主要作用。與對照相比，GML、GMM、GMH、BML和BMH處理下，酸桿菌門占比最高，分別為33.22%、35.46%、32.25%、27.54%和33.48%，而在對照和BMM處理中，變形菌門占比最高，分別為27.30%和27.89%。酸桿菌門群落的大量存在與蓮霧園區偏酸性的磚紅壤類型密切相關[22]。由于不同施肥方式及其不同濃度處理導致土壤理化性質發生改變，對土壤各個優勢菌群的影響存在一定的差異（如BMM）。

為進一步細化分析細菌群落結構間的差異，在屬分類學水平上開展分析，共檢測出418個屬（如圖2B）。除GML處理外，在其余的6個處理中（含CK），綠彎菌門下的一個分屬JG37-AG-4所占比例最高，其中CK、GMM、GMH、BML、BMM、BMH處理的占比分別為13.00%、12.36%、15.89%、9.50%、16.21%、14.30%。而在GML處理中，優勢菌屬為酸桿菌門下的一個分屬Subgroup_2，其占比為11.57%。

由不同施肥處理的土壤細菌OTU維恩圖（圖3）可知，3種施肥處理類型，細菌OTU總量為2443個，而共有OTU為1719個，占比70.4%;CK、GM和BM處理特有的OTU數量分別為20、67和80個，占比分別為0.8%、2.7%和3.3%。表明不同濃度羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥處理蓮霧園區土壤細菌群落結構具有一定的相似性和差異性。

2.4? 蓮霧園區土壤細菌群落空間差異物種（Biomarker）分析

根據不同施肥處理下，蓮霧園區土壤細菌群落的組間差異物種（Biomarker）進行LEfSe分析，將LDA的閾值設定為3.5，發現不同處理組間（CK處理組、GM處理組、BM處理組）的差異顯著菌群（圖4），并對不同差異的群落物種進行門、綱、目、科、屬、種的分支情況展開分析（圖5）。發現不同施肥處理組中共存在37個顯著差異的物種，其中CK處理組中具有顯著性差異的物種最多（20個種群：2個綱，3個目，6個科，4個屬，5個種），其次為GM處理組（11個種群：2個綱，3個目，2個科，2個屬，2個種），最后是BM處理組（6個種群：1個綱，1個目，1個科，2個屬，1個種）。

3? 討論

反季節蓮霧不僅可以滿足消費市場的需求，還可以增加果農的經濟收入，顯著提高果農的經濟效益。蓮霧在進行反季節催花調控時，為了提高產量和品質，降低反季節生產對植株的損傷，需要施用催花肥，促進植株生長。催花肥的施用量或施用類型都會改變土壤理化性質，從而對蓮霧園區土壤細菌群落多樣性產生影響[8]。目前，蓮霧催花肥的施用類型中，主要有無機肥、有機肥、微生物菌肥等。本文對施用羊糞有機肥和添加無機肥、菌劑的香蕉莖稈有機菌肥的蓮霧園區土壤細菌群落進行分析，發現不同施肥處理對土壤理化指標的影響存在顯著差異。

細菌群落的豐度和多樣性對土壤微環境的穩定性起著不可或缺的作用。人工施肥或添加外源菌劑等方式致使外界因素發生變化時，土壤細菌群落會隨之發生變化[23-26]。本文基于Illumina MiSeq高通量測序技術，分析羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥對蓮霧園區土壤細菌群落多樣性的影響，發現表征土壤細菌豐富度的ACE、Chao1指數，以及指示細菌多樣性的Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數大小順序為BML=GML> GMM=BMH>CK>GMH=BMM。同時與對照相比，發現土壤細菌群落會隨著施肥類型和濃度的變化而發生顯著性變化，與前人研究結果相一致[27-28]。無論是羊糞有機肥還是香蕉莖稈有機菌肥，低濃度（2 kg/株）施用時，土壤細菌群落的多樣性顯著高于同類型肥料的其他處理濃度，但在低濃度處理下的2種肥料之間無顯著差異。從多樣性和豐富度的角度分析，施用低濃度（2 kg/株）的有機肥（含羊糞有機肥和香蕉莖稈有機菌肥）有利于提高土壤細菌群落的穩定性，與前人研究結果大致一致[29-30]。

門分類水平分析表明，酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）是不同施肥處理蓮霧園區土壤中的優勢菌門，與前期研究結果大致相同[31]。其中，酸桿菌門（Acidobacteria）占比最大，與試驗地區磚紅壤的酸堿度存在一定的相關性，酸桿菌門在土壤生態循環中具有重要作用[32]。綠彎菌門（Chloroflexi）細菌是一種含有綠色色素的細菌門類，其豐富度與土壤的保水性和植株的生物量存在顯著正相關[33-34]。變形菌門（Proteobacteria）是細菌中最大的一門，包括病原菌和固氮菌等。屬分類水平分析表明，在BML、GMM、BMH、CK、GMH、BMM等6個處理中，綠彎菌門下的一個分屬JG37-AG-4所占比例最高，而在GML處理中，優勢菌屬為酸桿菌門下的一個分屬Subgroup_2占比最大。表明不同施肥類型和施肥濃度處理下的蓮霧園區土壤細菌群落結構存在一定的相似性和差異性。基于LEfSe分析，對照組（CK組）、羊糞有機肥處理組（GM組）和香蕉莖稈有機菌肥處理組（BM組）中，共檢測到37個具有顯著差異的物種，其中CK組20個，GM組11個，BM組6個。表明不同類型施肥處理形成了不同施肥特有的細菌組成，這一結果與維恩圖分析結果相一致。

參考文獻

[1]? 閆? 冰， 齊? 月， 付? 剛， 等. 莠去津對野生植物群落下土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 環境科學研究， 2017， 30（8）： 1246-1254.

[2]? Richard D B， Chris F， Nicholas J O. Microbial contributions to climate change through carbon cycle feedbacks[J]. The ISME Journal， 2008， 2（8）： 805-814.

[3]? Bryan S G， Laurent P. Insights into the resistance and resilience of the soil microbial community[J]. FEMS Microbiology Reviews， 2013， 37（2）： 112-129.

[4]? Campbell V， Murphy G， Romanuk T N. Experimental design and the outcome and interpretation of diversity-stability relations[J]. Oikos， 2011， 120（3）： 399-408.

[5]? Jiang L， Pu Z C. Different effects of species diversity on temporal stability in single-trophic and multitrophic communities[J]. American Naturalist， 2009， 174（5）： 651-659.

[6]? Konopka A. What is microbial community ecology？[J]. The ISME Journal， 2009， 3（11）： 1223-1230.

[7]? 龐鳳梅. 有機無機肥料配施對麥田土壤氨揮發和硝態氮含量的影響[D]. 北京： 中國農業科學院， 2008.

[8]? 閆? 晗， 吳祥云， 黃? 靜， 等. 評價土壤質量的微生物指標及其研究方法[J]. 山西農業科學， 2010， 38（10）： 78-81.

[9]? 李國慶， 郭華春. 連作對馬鈴薯根際土壤細菌群落結構的影響[J]. 分子植物育種， 2014， 12（5）： 914-928.

[10]????? Prosser J I. Molecular and functional diversity in soil micro-organisms[J]. Plant Soil， 2002， 244（1/2）： 9-17.

[11]????? Mori H， Maruyama F， Kato H， et al. Design and experimental application of a novel non-degenerate universal primer set that amplifies prokaryotic 16S rRNA genes with a low possibility to amplify eukaryotic rRNA genes[J]. DNA Research， 2014， 21（2）： 217-227.

[12]???? 樓? 駿， 柳? 勇， 李? 延. 高通量測序技術在土壤微生物多樣性研究中的研究進展[J]. 中國農學通報， 2014， 30（15）： 256-260.

[13]????? Poisot T， Péquin B， Gravel D. High-throughput sequencing： A roadmap toward community ecology[J]. Ecology and Evolution， 2013， 3（4）： 1125-1139.

[14]????? Sun H Y， Deng S P， Raun W R. Bacterial community structure and diversity in a century-old manure-treated agroecosystem[J]. Applied & Environmental Microbiology， 2004， 70（10）： 5868-5874.

[15]???? Hamm A. Bacterial Community Ecology and Fate in Integrated Livestock Production Systems[D]. Winnipeg： University of Manitoba， 2014.

[16]????? 孫鴻烈， 劉光崧. 土壤理化分析與剖面描述[M]. 北京： 中國標準出版社， 1996： 9-41.

[17]????? Caporaso J G， Kuczynski J， Stombaugh J， et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods， 2010， 7（5）： 335-336.

[18]????? Schloss P D， Gevers D， Westcott S L. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA- based studies[J]. PLoS One， 2011， 6（12）： e27310.

[19]????? Schloss P D， Westcott S L， Ryabin T， et al. Introducing mothur： open-source， platform-independent， community- supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（23）： 7537-7541.

[20]????? Lozupone C， Lladser M E， Knights D， et al. UniFrac： An effective distance metric for microbial community comparison[J]. The ISME Journal， 2011， 5（2）： 169-172.

[21]????? Hong C， Si Y， Xing Y， et al. IlluminaMiSeq sequencing investigation on the contrasting soil bacterial community structures in different iron mining areas[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2015， 22（14）： 10788- 10799.

[22]????? 海南省農業廳土肥站. 海南土壤[M]. 海口： 海南出版社， 1993： 12.

[23]????? Shen J P， Zhang L M， Guo J F， et al. Impact of long-term fertilization practices on the abundance and composition of soil bacterial communities in Northeast China[J]. Applied Soil Ecology， 2010， 46（1）： 119-124.

[24]????? Chu H Y， Fierer N， Lauber C L， et al. Soil bacterial diversity in the Arctic is not fundamentally different from that found in other biomes[J]. Environmental Microbiology， 2010， 12（11）： 2998-3006.

[25]????? Vasvi C， Ateequr R， Aradhana M， et al. Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments[J]. Microbial Ecology， 2012， 64（2）： 450-460.

[26]????? Chandra S N， Puneet S C， Chittranjan R B. Changes in soil physico-chemical properties and microbial functional diversity due to 14 years of conversion of grassland to organic agriculture in semi-arid agroecosystem[J]. Soil and Tillage Research， 2010， 109（2）： 55-60.

[27]????? 龐? 欣， 張福鎖， 王敬國. 不同供氮水平對根際微生物量氮及微生物活度的影響[J]. 植物營養與肥料學報， 2000， 6（4）： 476-480.

[28]????? Debosz K， Rasmussen P H， Pedersen A R. Temporal variations in microbial biomass C and cellulolytic enzyme activity in arable soils： effects of organic matter input[J]. Applied Soil Ecology， 1999， 13（3）： 209-218.

[29]????? 蔡燕飛， 廖宗文， 章家恩， 等. 生態有機肥對番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響[J]. 應用生態學報， 2003， 14（3）： 349-353.

[30]????? 李東坡， 武志杰， 陳利軍. 有機農業施肥方式對土壤微生物活性的影響研究[J]. 中國生態農業學報， 2005， 13（2）： 99-101.

[31]????? 吳? 斌， 王必尊， 王麗霞， 等. 不同催花肥對蓮霧根際土壤細菌群落多樣性的影響[J]. 環境科學研究， 2018， 31（4）： 732-741.

[32]????? 商麗榮， 萬里強， 李向林. 有機肥對羊草草原土壤細菌群落多樣性的影響[J]. 中國農業科學， 2020， 53（13）： 2614-2624.

[33]????? Iino T， Mori K， Uchino Y， et al. Ignavibacterium album gen. nov.， sp. nov.， a moderately thermophilic anaerobic bacterium isolated from microbial mats at a terrestrial hot spring and proposal of Ignavibacteria classis nov.， for a novel lineage at the periphery of green sulfur bacteria[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2010， 60（6）： 1376-1382.

[34]????? Podosokorskaya O， Kadnikov V， Gavrilov S N， et al. Characterization of Melioribacter roseus gen. nov.， sp. nov.， a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium from the class Ignavibacteria， and a proposal of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae[J]. Environmental Microbiology， 2013， 15（6）： 1759-1771.

責任編輯：謝龍蓮