橡膠樹前纖維蛋白（profilin）基因家族的鑒定及表達分析

鄧治 李德軍

摘? 要：肌動蛋白細胞骨架可能在橡膠樹乳管傷口堵塞過程中發揮重要作用。前纖維蛋白（profilin）是肌動蛋白動態平衡的重要調節子，但對橡膠樹profilin基因家族系統研究的報道較少。通過分析橡膠樹基因組和轉錄組數據，鑒定到6個橡膠樹profilin基因，對其基本特性及蛋白保守基序、結構特征、進化關系和表達模式等進行分析?；蚪Y構分析表明，橡膠樹profilin基因都包含3個外顯子2個內含子，編碼的蛋白序列含有profilin蛋白特有的保守基序KYMVIQGE和VIRGKKG。進化分析顯示，橡膠樹profilin并未嚴格分為營養型和生殖型2種類型。profilin蛋白二級結構以無規則卷曲為主，三級結構均包含3個α螺旋和7個β折疊。表達分析結果顯示，4個profilin基因在膠乳中高表達，橡膠樹排膠和碘化鉀處理調控這4個profilin基因表達，推測profilin基因參與橡膠樹排膠過程。該研究結果為進一步闡明橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎。

關鍵詞：前纖維蛋白基因家族;橡膠樹;排膠;表達分析

中圖分類號：S794.1????? 文獻標識碼：A

Identification and Expression Analysis of profilin Gene Family in Hevea brasiliensis

DENG Zhi， LI Dejun*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Actin cytoskeleton might play an important role in laticifer wound plugging of Hevea brasiliensis. Although profilin is a vital regulator in actin dynamics， there is still no systematic study on profilin gene family in Hevea brasiliensis. In this study， six profilin genes were identified from the genome and transcriptome of Hevea brasiliensis. The six genes were analyzed in details， including gene basic characteristics， conserved protein motifs， structure features， evolutionary relationships， and expression profiles. Gene structure analyses demonstrated that the six profilin genes contained three exons and two introns. Conserved domain analyses indicated that the six profilin proteins possessed unique motifs of profilin protein， KYMVIQGE and VIRGKKG motifs. Evolutionary analyses showed that Hevea profilins were not strictly divided into vegetative and reproductive subclasses. The main secondary structures of profilin proteins were random coil and tertiary structures consist of three α helices and seven β turns. Expression analyses showed that four profilin genes were highly expressed in latex， and regulated by latex flow and potassium iodide treatment， suggesting that profilin genes might be involved in latex flow. These results would lay a foundation for further elucidating profilin roles in laticifer wound plugging and latex flow of Hevea brasiliensis.

Keywords： Profilin gene family; Hevea brasiliensis; latex flow; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.002

微絲是細胞骨架的重要組分，肌動蛋白單體是構成微絲的基本單位。真核細胞的肌動蛋白細胞骨架可通過快速動態重組來響應胞內外信號，從而調控許多重要的細胞過程，例如胞質流動[1]、細胞器運動、細胞形態建成、細胞分裂和分化[2]、頂端生長[3]、病原菌[4]、脅迫[5]和激素[6]響應等。肌動蛋白結合蛋白（actin binding protein，ABP）通過提高或抑制肌動蛋白的聚合來調節肌動蛋白動態重組[2]。植物ABP由多個基因家族構成，其中前纖維蛋白（profilin）是表達量較高的一個ABP家族。Profilin分子量為12～16 kDa[7]，是一種高度保守的肌動蛋白單體結合蛋白。動物細胞中profilin具有2種不同的功能，一方面，profilin結合G-actin，阻止肌動蛋白自發成核，抑制微絲聚合[8]。另一方面，profilin可促進ATP/ADP交換，將G-actin-ATP定位到能提高肌動蛋白裝配的微絲正端，促進單體結合到微絲上使微絲生長[9]。此外，profilin還能與磷酸肌醇[10]、poly-L-脯氨酸[11]和Arp2-3復合體[12]結合。綜上所述，profilin在肌動蛋白動力學中扮演著關鍵角色，為肌動蛋白細胞骨架重排與多種細胞過程中的信號傳導途徑間提供連接。

首個植物profilin蛋白在樺樹花粉過敏原中發現[13]，隨后在擬南芥、水稻、楊樹、玉米和橡膠樹等植物中也發現profilin的存在。植物profilin與非植物profilin蛋白氨基酸序列一致性為25%左右，植物profilin同樣具有抑制微絲聚合的作用，但目前未發現植物profilin能促進核苷酸ATP/ADP交換的功能[14]。高等植物profilin可分為營養型和生殖型2類[15-16]，如營養型的擬南芥PRF1、PRF2和PRF3幾乎在所有組織中都表達，生殖型的擬南芥PRF4和PRF5主要在成熟花粉中表達。profilin在植物中具有多種功能，例如在擬南芥細胞擴張過程中參與formin介導的肌動蛋白成核和纖絲裝配[17]，調控極性花粉管生長中頂端肌動蛋白聚合[18]，參與擬南芥蓮座葉和花序形態建成[19]，通過負調控formin介導的肌動蛋白裝配來調節PAMP觸發的植物免疫[20]。棉花過表達GhPFN2基因能增強對黃萎病抗性[21]。大量研究表明profilin還是一種極具交叉反應性的植物變應原[22]。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產巴西亞馬遜河流域，其產生的膠乳是目前天然橡膠最重要的來源。有研究表明肌動蛋白微絲骨架可能在橡膠樹乳管傷口堵塞、產膠和死皮等過程中發揮重要作用[23-25]。作為肌動蛋白微絲骨架重要調節子的profilin在橡膠樹中的研究報道較少。2001年Ganglbergera首次克隆了1個橡膠樹profilin基因，該基因表達的蛋白是膠乳過敏原Hev b 8[26]。2011年筆者克隆了另一個橡膠樹profilin基因，并對其進行生物信息學分析[27]。本研究利用橡膠樹基因組和轉錄組數據鑒定橡膠樹profilin家族基因，并對其基本特性及蛋白結構特征、進化關系和表達模式等進行分析，該研究結果為進一步闡明橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本研究所用材料為中國熱帶農業科學院試驗農場種植的橡膠樹品系‘熱研7-33-97。將3%碘化鉀（KI）溶液涂抹在7年生未開割橡膠樹幼樹割面上、下2 cm范圍內，用黑色塑料布包裹避光，分別于處理后0、6、24、48 h采集膠乳。選取10年生橡膠樹，采集割膠后0～5 min、>5～35 min、>35 min至停止排膠3個時間段的膠乳，分別記為T1、T2和T3。所有樣品經液氮冷凍后置于–80 ℃保存備用。

1.1.2? 試劑? 通用植物總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;反轉錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis購自Thermo Scientific公司;熒光定量PCR試劑TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）為寶生物工程（大連）有限公司產品。引物合成由廣州英駿生物公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹profilin基因家族的鑒定? 橡膠樹profilin基因的篩選方法如下，在橡膠樹數據庫HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/home/index）中搜索profilin序列，篩選出注釋為profilin的相關基因。在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中將擬南芥profilin基因序列與橡膠樹轉錄組數據進行BLAST比對，篩選出與擬南芥profilin基因同源的序列。將2種方法篩選得到的profilin基因序列進行比對去除冗余序列，利用pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）分析橡膠樹profilin蛋白的保守結構域，確定橡膠樹profilin基因序列。利用DNAMAN軟件進行序列比對。根據橡膠樹profilin的基因組序列和轉錄組序列確定內/外含子數目和位置。

1.2.2? 橡膠樹profilin蛋白特性及結構分析? 利用在線軟件ProtParam （https：//web.expasy.org/ protparam/）預測橡膠樹profilin蛋白的理化性質。利用PSORT （https：//psort.hgc.jp/）在線預測橡膠樹profilin蛋白的亞細胞定位。通過SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預測橡膠樹profilin蛋白的二級結構。以擬南芥profilin蛋白的三維結構（PDB：6IQI）為模板，通過SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對橡膠樹profilin蛋白三級結構進行同源建模。利用PyMOL軟件顯示橡膠樹profilin蛋白的三級結構。

1.2.3? 橡膠樹profilin蛋白進化分析? 在NCBI和Phytozome網站下載擬南芥、水稻、楊樹、玉米、葡萄、蓖麻和麻風樹的profilin蛋白氨基酸序列，結合橡膠樹profilin蛋白序列，利用MEGA軟件中的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4? 橡膠樹profilin基因家族組織表達分析? 在橡膠樹數據庫HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/ home/index）中下載6個橡膠樹組織的RNA-Seq數據，對橡膠樹profilin基因的組織表達量進行歸一化/標準化處理，用R軟件中的pheatmap函數繪制基因表達熱圖。

1.2.5? qRT-PCR分析? 根據橡膠樹profilin基因家族組織表達的結果，選取膠乳中高表達的4個橡膠樹profilin基因，設計qRT-PCR引物。由于橡膠樹profilin基因家族保守性較高，引物設計盡量避開保守結構域。以橡膠樹18S rRNA基因（GenBank登錄號AB268099）作為內參基因。本研究所用引物序列見表1。qRT-PCR反應體系為20 μL。反應參數為94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共反應40個循環。每樣品均為3次重復?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCT計算。

2? 結果與分析

2.1? 橡膠樹profilin基因家族鑒定

對橡膠樹基因組和轉錄組數據進行比對，結合profilin蛋白保守結構域分析，最后確定6個橡膠樹profilin家族基因，命名為HbPRF1～HbPRF6（表2）。橡膠樹profilin家族基因ORF長度為396 bp或402 bp，編碼氨基酸長度為131或133個氨基酸，蛋白分子量為14.00～14.35 kDa，等電點范圍為4.63～5.02。6個橡膠樹profilin蛋白均為親水蛋白和穩定蛋白。蛋白序列比對顯示6個橡膠樹profilin蛋白高度保守，含有profilin的保守基序KYMVIQGE、VIRGKKG、LAPTG、PGQCN、MSWQ、GDYL、YVD、KKT和AAI，其中KYMVIQGE和VIRGKKG為profilin特有基序（圖1）?；蚪Y構分析顯示6個橡膠樹proflin基因都包含3個外顯子和2個內含子（圖2）。蛋白質亞細胞定位表明6個橡膠樹profilin蛋白均定位于細胞質。

橫線表示profilin蛋白的保守基序。

藍色方框表示外顯子，黑色線條表示內含子。

2.2? 橡膠樹profilin蛋白高級結構預測分析

為進一步研究橡膠樹profilin蛋白空間結構特性，對橡膠樹profilin蛋白進行二級結構預測（表3）。6個橡膠樹profilin蛋白都以無規則卷曲為主，其中無規則卷曲比例為35.34%～41.98%，α螺旋比例為22.14%～30.83%，延伸鏈比例為23.31%～25.19%，β折疊比例為6.87%～10.69%。對蛋白三級結構進行分析，6個橡膠樹profilin蛋白的三級結構相似，均包含3個α螺旋和7個β折疊（圖3）。上述蛋白結構預測結果說明6個橡膠樹profilin蛋白結構高度保守。

2.3? 植物profilin蛋白進化關系分析

為研究橡膠樹profilin蛋白的進化關系，使用MEGA軟件構建橡膠樹與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白家族系統進化樹。根據進化樹的分支（圖4），可將植物profilin蛋白家族分為2個亞AtPRF1～AtPRF5： Arabidopsis thaliana （AAB39480.1， AAB39481.1， Q9FE63.2， AAB39477.1， AAB39479.1）; OsPRF1～OsPRF2： Oryza sativa （BAD69332.1， AAK92580.1）; ZmPRF1～ZmPRF6： Zea mays （CAA51718.1， CAA51719.1， CAA51720.1， AAB86960.1， AAG35601.1， ONM38364.1）;PtPRF1～PtPRF3： Populus trichocarpa （XP_002304225.1， XP_002299743.1， XP_011000942.1）; VvPRF1～VvPRF4： Vitis vinifera （XP_002274966.3， XP_002283450.1， XP_002283490.1， XP_010656249.1）; JcPRF1～JcPRF3： Jatropha curcas （NP_001295719.1， XP_012069066.1， XP_012076840.1）; RcPRF1～RcPRF3： Ricinus communis （XP_002514199.1， XP_002515952.1， XP_002514198.1）; CcPRF： Colletotrichum chlorophyti （OLN95629）.族，擬南芥營養型的AtPRF1、AtPRF2和AtPRF3聚為一個亞族，HbPRF1～HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等植物profilin蛋白聚為另一個亞族。其中HbPRF1和HbPRF2與麻風樹PRF1和蓖麻PRF1聚為一支，HbPRF3和HbPRF4與麻風樹PRF3和蓖麻PRF2聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等聚為一支。值得注意的是，單子葉植物profilin蛋白聚為一支，其中營養型和生殖型profilin分別聚為2個亞支。說明profilin蛋白進化早于單、雙子葉植物分化，橡膠樹profilin蛋白與同為大戟科的麻風樹和蓖麻親緣關系較近。

2.4? 橡膠樹profilin基因家族的表達分析

2.4.1? HbPRFs的組織表達模式? 由圖5可知，HbPRF1和HbPRF2在所有檢測的組織中均有較高的表達，其中膠乳中表達量最高;HbPRF3在所有檢測組織中幾乎不表達;HbPRF4在所有檢測組織中均表達，其中膠乳中表達量最高，葉片中表達量最低;HbPRF5在雄花中表達量最高，膠乳中幾乎不表達;HbPRF6在葉片中表達量最低，在膠乳中表達量最高。上述結果表明，6個橡膠樹profilin基因中有4個在膠乳中表達量最高，說明這4個profilin基因可能在膠乳中發揮重要作用。

2.4.2? HbPRFs在不同排膠時間的表達模式? 微絲細胞骨架在橡膠樹排膠過程中具有重要作用。根據HbPRFs組織表達分析結果，選擇HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個在膠乳中高表達的基因，進一步研究其排膠相關處理條件下的表達模式。結果顯示（圖6），HbPRF1隨著排膠時間延長表達量逐漸上調，HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等3個基因在T2排膠時間段表達量下調，T3排膠時間段上調表達。其中HbPRF2在T3排膠時間段中的表達量高于T1排膠時間段。而HbPRF4和HbPRF6在T3排膠時間段中的表達量稍低于T1排膠時間段。說明HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個基因的表達與橡膠樹排膠有關。

2.4.3? KI處理下HbPRFs的表達模式? 由圖7可知，微絲解聚劑KI處理可誘導HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6基因表達，HbPRF4最高表達量出現在處理后48 h，約為0 h表達量的14倍。其余3個HbPRFs的最高表達量都出現在KI處理后24 h。上述結果提示，HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個基因可能參與橡膠樹膠乳中KI調控微絲解聚過程，其中HbPRF4與碘化鉀引起的微絲解聚最為相關。

3? 討論

基因組測序技術的高速發展使得全面篩選和鑒定重要的基因家族成為可能。profilin基因家族是一個古老且普遍存在功能分化的家族，調節生物細胞發育的各個方面。本研究利用橡膠樹基因組和轉錄組數據結合生物信息學系統分析，鑒定到6個橡膠樹profilin基因，說明橡膠樹profilin基因家族成員數量與其他植物類似，如擬南芥有5個profilin基因[15， 19]，玉米有6個profilin基因[14]。Profilin蛋白序列中的KYMVIQGE和VIRGKKG為其獨有的保守基序，此外還包括8個3～5位氨基酸的保守基序[28]。序列分析發現除HbPRF6中AAI基序變為ASI序列外，其余橡膠樹profilin蛋白序列均含有上述保守基序?；蚪Y構分析顯示橡膠樹profilin基因均由3個外顯子和2個內含子組成。蛋白結構分析顯示橡膠樹profilin蛋白二級結構都以無規則卷曲為主，三級結構均包含3個α螺旋和7個β折疊。值得注意的是HbPRF5和HbPRF6一致性雖然很高（97.76%），但在膠乳和葉片中的表達模式出現明顯差異，HbPRF5蛋白的AAI保守基序在HbPRF6中變為ASI序列，僅這1個氨基酸的差異，可能會造成這2個蛋白功能的差異。

為研究橡膠樹profilin蛋白的進化關系，對橡膠樹與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白進行進化分析。結果顯示雙子葉植物擬南芥的profilin蛋白分為營養型和生殖型2個亞族。橡膠樹profilin蛋白與擬南芥生殖型profilin蛋白聚為一個亞族，在該亞族中HbPRF1和HbPRF2聚為一支，HbPRF3和HbPRF4聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5聚為一支，單子葉植物profilin蛋白聚為一支。說明profilin作為一個古老的蛋白進化發生在雙子葉和單子葉物種分化之前，這與Pandey等[28]結果一致。蛋白進化分析結果顯示橡膠樹profilin并未嚴格分為營養型和生殖型2種類型，組織表達結果與進化分析結果一致，橡膠樹profilin基因沒有在營養型和生殖型組織中存在特異性或顯著性差異表達，表明橡膠樹profilin蛋白進化過程較復雜，這可能與橡膠樹次生代謝產物——膠乳中肌動蛋白發揮重要和特殊的功能有關。

根據細胞所處的不同狀態，profilin具有兩種相反的功能，既能調控肌動蛋白聚合過程也能調控肌動蛋白解聚過程。雖然目前對植物profilin是否具有促進ATP/ADP交換的功能仍有爭議[14]，但研究發現與植物profilin結合的肌動蛋白單體可以添加到肌動蛋白絲的正端，促進G-肌動蛋白聚合為微絲[9]。擬南芥profilin下調導致F-肌動蛋白數量下降，頂端分生組織中肌動蛋白絲紊亂[18]。排膠時間是決定橡膠樹膠乳產量的一個重要限制因素，乳管傷口堵塞物形成的速度決定著排膠時間的長短。微絲細胞骨架在橡膠樹乳管堵塞過程中具有重要作用[23-25]。割膠后5 min的橡膠樹割面的乳管傷口末端出現蛋白質，隨著排膠進行乳管傷口末端的蛋白質逐漸積累。當排膠終止時蛋白質大量積累在乳管傷口末端形成一個網狀結構[25， 29]。該蛋白質網起到堵塞乳管和保護乳管傷口的作用[29]。隨著排膠的進程肌動蛋白在割膠后的乳管傷口末端逐漸聚集。橡膠樹排出的膠乳中肌動蛋白含量逐漸減少，說明膠乳中的肌動蛋白可能在排膠過程中逐漸截留在乳管傷口處[23]。本研究發現，雖然HbPRF2表達在排膠中期稍有下調，但排膠末期與排膠初期時相比HbPRF1和HbPRF2的表達明顯上調。說明排膠過程中HbPRF1和HbPRF2上調可能促進微絲逐漸聚合，這與排膠過程中肌動蛋白逐漸截留在乳管傷口末端的結果相符，說明profilin在橡膠樹乳管堵塞過程中可能發揮重要作用。本研究發現KI處理導致微絲解聚的同時也引起橡膠樹profilin基因上調表達。KI處理導致微絲快速解聚[30]，可能造成細胞內G-肌動蛋白大量積累，為維持胞內肌動蛋白動態平衡，profillin與G-肌動蛋白形成復合體，封存G-肌動蛋白，從而抑制微絲的聚合，但還需進一步的實驗驗證。

4? 結論

本研究對橡膠樹profilin基因家族成員進行了基本特性及蛋白結構特征、進化關系和表達模式等進行分析。結果表明profilin基因在橡膠樹排膠過程中發揮重要作用。本研究為后續橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用研究奠定基礎。

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責任編輯：黃東杰