離子色譜法測定硫酸氨基葡萄糖膠囊中硫酸根離子含量

張建敏，周長明，郭 雷，張雪艷

（北京市藥品檢驗所·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

氨基葡萄糖是從甲殼動物外殼中提取的一種天然氨基單糖，是糖胺聚糖和透明質(zhì)酸重要的結(jié)構(gòu)成分，在人體內(nèi)具有潛在保護(hù)軟骨作用，硫酸基在葡胺聚糖的合成過程中非常重要［1－2］。由于氨基葡萄糖極不穩(wěn)定，故將其制成鹽的形式增加穩(wěn)定性，常見成鹽形式為鹽酸氨基葡萄糖和硫酸氨基葡萄糖。目前，2015 年版《中國藥典（一部）》中并未收載硫酸氨基葡萄糖膠囊；國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［3］中并未規(guī)定硫酸鹽檢查項；進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)JX20160314［4］中硫酸鹽測定方法為重量法，先將樣品溶解，使溶液酸化，再根據(jù)氯化鋇與硫酸根生成硫酸鋇沉淀反應(yīng)，經(jīng)過濾、洗滌、烘干、稱重，計算硫酸根離子的含量。該方法操作煩瑣、耗時，影響因素較多。離子色譜法是采用高壓輸液泵將洗脫液泵入色譜柱中，對可解離物質(zhì)進(jìn)行分離測定的色譜方法［5］，廣泛用于測定無機(jī)陰離子、無機(jī)陽離子、有機(jī)酸、糖等成分的含量，在藥品、水質(zhì)、環(huán)境、生物、電氣等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用［6－13］。本研究中建立了測定硫酸氨基葡萄糖膠囊中硫酸根離子含量的離子色譜－抑制電導(dǎo)法，為提高硫酸氨基葡萄糖膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo ICS－3000 型離子色譜儀，AERS 500 型抑制器（規(guī)格為4 mm），均購自賽默飛世爾科技公司；賽多利斯Arium? Pro 型超純水機(jī)（德國賽多利斯公司）；XA205 型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國計量科學(xué)研究院，批號為17083，質(zhì)量濃度為1 000 μg／mL）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水；硫酸氨基葡萄糖膠囊（廠家A，批號分別為1901975，1902812，1902941）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

保護(hù)柱：DionexIonPacTMAG11－HC 柱（50mm×4mm）；分析柱：Dionex IonPacTMAS11－HC 柱（250 mm×4 mm）；淋洗液：20 mmol／L 氫氧化鉀溶液；流速：1.5 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。

2.2 溶液制備

精密量取硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 000μg／mL）1 mL，置10 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25，30 μg／mL 的對照品溶液。取樣品，棄去囊殼，取粉末1.0 g，置100 mL 容量瓶中，振搖30 min，用水定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。以水作為空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各25 μL，按2.1 項下色譜條件注入離子色譜儀測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)峰出現(xiàn)，且空白溶劑對測定結(jié)果無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察、檢測限和定量限確定：取2.2 項下質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25，30 μg／mL 的系列對照品溶液，按2.1 項下色譜條件分別注入色譜儀，以硫酸根離子質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝0.107 4X－0.085，r＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，硫酸根離子質(zhì)量濃度在5～30 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取硫酸根離子對照品溶液（質(zhì)量濃度為15 μg／mL），用水稀釋，以信噪比（S／N）為3 時的質(zhì)量濃度為檢測限，S／N為10 時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果定量限為0.15 μg／mL，檢測限為0.03 μg／mL。本方法所做標(biāo)準(zhǔn)曲線6 個點均在定量限以上，表明結(jié)果可靠。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為15μg／mL）適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果硫酸根離子峰面積的RSD為0.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為1902812）適量，按2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下方法進(jìn)樣測定。結(jié)果硫酸根離子平均含量的RSD為0.50%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為1902812）適量，按2.2項下方法平行制備供試品溶液，于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果硫酸根離子峰面積的RSD為0.91%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1902812）0.5g，精密稱定，置100mL 容量瓶中，振搖30min使溶解，用水定容至刻度，搖勻，過濾，作為貯備液；精密量取貯備液0.5 mL，共3 份，分別置100 mL 容量瓶中，精密量取對照品溶液（質(zhì)量濃度為100 μg／mL）4.0，6.0，8.0 mL，置上述100 mL 容量瓶中，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 份，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。取上述溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法計算加樣回收率。結(jié)果硫酸根離子回收率平均值為100.82%，RSD為0.59%（n＝9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為1901975，1902812，1902841）樣品，依法制備供試品溶液。分別采用離子色譜法和進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)JX20160314 中重量法測定硫酸根離子的含量。結(jié)果見表1。

表1 離子色譜法與重量法測定硫酸根離子含量結(jié)果比較（g）Tab.1 Comparison of content determination results of sulfate ion by ion chromatography and gravimetric method（g）

1.硫酸根離子A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.空白溶劑圖1 離子色譜圖1.sulfate ionA.Reference solution B.Test solution C.Blank solventFig.1 Ion chromatogram

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和淋洗液配制考察

由于試劑和容器中不可避免存在一些干擾離子，故配制系列對照品溶液時均直接吸取硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 000 μg／mL），一步完成稀釋，盡可能減少外界可能引入的誤差。試驗中用到的淋洗液須一次性足量配制，以確保硫酸根離子保留時間的穩(wěn)定和基線的平穩(wěn)，避免人工配制淋洗液帶來的誤差，儀器狀態(tài)可更加穩(wěn)定。

3.2 淋洗液選擇和濃度確定

氫氧化鉀溶液的背景電導(dǎo)低，噪聲小，靈敏度高，無水負(fù)峰，故確定為淋洗液。先后采用40 mmol ／L和20 mmol ／L 氫氧化鉀溶液進(jìn)行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用20 mmol／L 氫氧化鉀溶液可提高硫酸根離子與相鄰氯離子輔料峰的分離度。

3.3 流速確定

一般情況下，流速與淋洗液出峰時間成呈正相關(guān)，流速增大，保留時間明顯縮短，但系統(tǒng)壓力會升高，流速的增加受分離柱最大操作壓力限制；另一方面，流速減小，保留時間會延長，且峰形會變寬。綜合考慮系統(tǒng)壓力和保留時間的影響，流速確定為1.5 mL／min，此時系統(tǒng)壓力為1 520 psi（柱子允許的最大壓力為3 000 psi），硫酸根離子出峰時間合適。

3.4 方法比較

硫酸根離子與氨基葡萄糖成鹽生成硫酸氨基葡萄糖，可提高氨基葡萄糖的穩(wěn)定性，但過量的硫酸根離子屬無機(jī)鹽雜質(zhì)。分別采用離子色譜法和重量法測定樣品中硫酸根離子的含量，結(jié)果2 種方法測定結(jié)果的差異較小，但離子色譜法可降低試驗過程中的操作誤差，重復(fù)性較好，也可縮短檢測時間，故可取代操作煩瑣的重量法［14－15］。

3.5 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，可用于測定硫酸氨基葡萄糖膠囊中硫酸根離子的含量。在離子色譜測定硫酸根離子的過程中發(fā)現(xiàn)存在氯離子，但硫酸氨基葡萄糖膠囊標(biāo)準(zhǔn)中未對氯離子進(jìn)行質(zhì)量控制，其可能來源于硫酸氨基葡萄糖膠囊生產(chǎn)過程的溶劑殘留，采用離子色譜法同時測定硫酸氨基葡萄糖膠囊中硫酸根離子和氯離子的含量將是后續(xù)研究的方向。