反相高效液相色譜法同時測定泌炎寧顆粒中綠原酸和蒙花苷含量*

李慶德，藍獻泉，鄭錦坤，馮 波，陳華龍，彭 晶

（1.粵北人民醫院，廣東 韶關 512026；2.廣東省韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512028）

泌炎寧顆粒由金銀花、野菊花、白茅根、廣金錢草、等中藥組方，常用于治療腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、盆腔炎及尿路結石等，可顯著促進肛腸類疾病術后尿潴留患者排尿及改善腹脹情況，縮短術后首次排尿時間［1］。泌炎寧顆粒質量標準中僅有白茅根和金銀花的薄層色譜鑒別。方中金銀花、野菊花具有清熱解毒、散瘀通經等功效；白茅根涼血止血，既能”引火下行”，又能“利尿通淋”。綠原酸和蒙花苷是上述3 味藥材的重要活性化合物，分屬有機酸類和黃酮類，二者均有抗菌、抗炎、免疫、抗腫瘤等藥理學作用［2－5］。本研究中采用反相高效液相色譜法同時測定泌炎寧顆粒中綠原酸和蒙花苷的含量，為控制制劑質量提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

20A 型高效液相色譜儀，包括SPD－20A 型紫外檢測器（日本Shimadzu 公司）；MSA225S－ICE－DU 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為十萬分之一）；AS10200ADT 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

泌炎寧顆粒（粵北人民醫院，批號分別為20190729，20191129，20191219，20200428）；綠原酸對照品（批號為110753－201817，含量為96.8%），蒙花苷對照品（批號為110821－201816，含量為97.50%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時9%A，10～35 min 時9%A→30%A，35～40 min 時30%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：334 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取綠原酸和蒙花苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為0.453 0，0.219 2 mg／mL 的混合對照品貯備液；分別精密量取0.50，1.00，2.00，4.00，6.00 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液。取樣品3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，室溫下超聲（功率為250 W，頻率為40kHz，下同）處理30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按泌炎寧處方和工藝制備缺金銀花、野菊花和白茅根的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按綠原酸峰計應不低于10 000，分離度均大于1.5，基線分離良好；陰性對照品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

線性關系考察：精密量取混合對照品溶液各適量，制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以待測成分質量濃度為橫坐標（X，μg／mL）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸和蒙花苷的回歸方程Y1＝29 813X1＋7 917（r＝0.999 2，n＝5），Y2＝22 051X2＋7 549（r＝0.999 0，n＝5）。結果表明，綠原酸和蒙花苷質量濃度分別在11.33～135.91 μg／mL和5.48～65.75 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果綠原酸和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.16%，0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果綠原酸和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.80%和1.04%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內基本穩定。

1.綠原酸 2.蒙花苷A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.chlorogenic acid 2.buddleosideA.Mix reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

重復性試驗：取樣品（批號為20200428）3 g，精密稱定，共6 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果綠原酸和蒙花苷含量的RSD分別為0.88%和1.27%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20200428）適量，共9 份，分別精密加入混合對照品貯備液0.60，1.00，1.40 mL，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取4 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果批號分別為20190729，20191129，20191219，20200428 的樣品中綠原酸和蒙花苷含量分別為0.296 mg／g和0.083 mg／g，0.247 mg／g和0.121 mg／g，0.399 mg／g和0.115 mg／g，0.302 mg／g和0.147 mg／g。

3 討論

泌炎寧顆粒組方中白茅根化學成分主要有白茅素和蘆竹素等三萜類、綠原酸等有機酸類、白頭翁素等內酯類，路金才等［6］的研究結果表明，并非所有產地的白茅根均含有蘆竹素和白茅素（如天津產的印度白茅根）。綜合文獻［7－8］及金銀花的含量測定其成分，本研究中以綠原酸和蒙花苷作為定量指標。

參考文獻［9－11］，預試驗中分別以100%，70%，50%甲醇作提取溶劑，考察對泌炎寧顆粒中綠原酸和蒙花苷提取率的影響，結果表明，以100%甲醇作溶劑時蒙花苷提取率明顯優于另2 種溶劑，而綠原酸無明顯差異。確定提取溶劑后，分別考察了超聲（15，30，60 min）和加熱回流（30，60，120 min）對提取率的影響，結果表明，超聲30 min 與加熱回流60 min 的提取效果無明顯差異，考慮到試驗操作的簡便性，故選擇超聲30 min 為最佳提取方法。

由含量測定結果可見，各批樣品中綠原酸和蒙花苷的含量差異較大，其原因除了與原材料產地有關外，還與生產工藝有較大關系。預試驗中以同一批原料對生產工藝進行考察，發現在制粒時由于綠原酸［3］和蒙花苷［12］對熱不穩定，兩種成分含量隨烘干溫度的升高和烘干時間的延長而逐漸減少，最終確定70 ℃烘干2 h 為最優烘干條件。

綜上所述，該方法操作簡便，重復性好，準確度高，可用于同時測定泌炎寧顆粒中綠原酸、蒙花苷的含量。