高效液相色譜法同時測定分心木中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷含量*

李 靜，賈文江，曹望弟，蘇陽陽

（陜西省商洛市藥品檢驗所，陜西 商洛 726000）

分心木為胡桃科植物胡桃Juglans regiaL.果核的干燥木質隔膜，性平，味苦、澀，入脾、腎經，具有補腎澀精功效，用于治療腎虛遺精、滑精、遺尿、尿血、帶下、瀉痢，收載于《陜西省中藥飲片標準（第三冊）》［1］。關于分心木含量測定報道較少，僅見該藥材活性鞣質［2］、浸出物含量［3］、氨基酸含量測定及綜合評價［4］，文獻［5］采用紫外－分光光度法測定了不同產地分心木中總黃酮含量，文獻［6］從核桃分心木的乙酸乙酯萃取部分分離純化得到金絲桃苷、槲皮素等10 個化合物。現行標準僅見性狀鑒別，本研究中建立了同時測定分心木中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷含量的高效液相色譜法，為全面控制該藥材的質量奠定了基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），配有紫外檢測器；SQP 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）；AS30600BDT 型超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；Hitech 型純水機（上海和泰儀器公司）；FW－200D 型高速萬能粉碎機（天津鑫博得儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（批號為100080－201408，含量為92.8%），槲皮素對照品（批號為100081－201610，含量為99.1%），金絲桃苷對照品（批號為111521－201809，含量為94.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。分心木藥材（批號分別為2020001，2020002，2020003，2020004），經陜西省商洛市藥品檢驗所曹望弟主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100－5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗 脫（0～10 min 時20%A，10～26 min 時39.5%A，26～30 min 時20%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成含蘆丁、槲皮素、金絲桃苷質量濃度分別為0.366，0.481，0.048 mg／mL 的混合對照品溶液。分別吸取2，5，10，15，20 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品粉末（過4 號篩）5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加70%乙醇50 mL，加熱回流提取6 h，提取液減壓干燥至近干，用甲醇定容至25 mL，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果各相鄰成分間分離度較好（R＞1.5），理論板數以蘆丁、槲皮素、金絲桃苷峰計均大于3 000。

線性關系考察與檢測限和定量限確定：取2.2 項下系列混合對照品溶液各10 μL，分別依次注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以待測成分對照品質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸。取2.2 項下混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，按各組分色譜峰信噪比（S／N）為3∶1和10∶1 時分別測定其檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。結果見表1。

精密度試驗：精密量取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次。結果見表1，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24 h 時進樣測定。結果見表1，表明供試品溶液在室溫下24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品粉末（過4 號篩）6 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算含量。結果見表1，表明方法重復性良好。

表1 分心木中3 種成分含量測定方法學考察結果Tab.1 Results of methodological investigation on content determination of three components in Diaphragma Juglandis Fructus

1.蘆丁 2.金絲桃苷 3.槲皮素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.rutin 2.hyperoside 3.quercetinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品粉末（過4 號篩）5.0 g，精密稱定，平行6 份，依法制備供試品溶液，分別加入蘆丁、槲皮素、金絲桃苷質量濃度為59.67，192.5，28.88 μg／mL 的混合對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取4批樣品（批號分別為2020001，2020002，2020003，2020004），按2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.1 項下色譜條件進樣測定3 次，并計算含量。結果見表3。

表3 分心木中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷含量測定結果（n＝3）Tab.3 Resuts of content determination of rutin，quercetin and hyperoside in Diaphragma Juglandis Fructus（n＝3）

3 討論

3.1 流動相選擇

參考文獻［7－15］，考察了乙腈－磷酸、乙腈－甲酸、乙腈－醋酸、甲醇－磷酸等流動相系統，綜合比較峰形、分離度、出峰時間等參數，選擇以乙腈－0.4%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，結果3 個指標色譜峰分離度和峰形均較好，理論板數最高，重復性最好。取蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品溶液，于250～450 nm 波長范圍內進行紫外掃描，結果蘆丁、槲皮素、金絲桃苷對照品均在360 nm 波長處有最大吸收。故選擇檢測波長為360 nm。

3.2 提取方法選擇

考察了鹽酸乙醇水解法、乙醇超聲法、連續回流提取法等不同提取方法的效果，結果70%乙醇連續回流提取法效果較好，樣品提取含量最高。

3.3 不同產地和來源樣品含量測定結果

比較樣品測定數據，發現新疆核桃分心木中蘆丁和槲皮素含量較高；陜西商洛紅皮核桃分心木蘆丁含量略低，商洛同一產地不同貯存時間分心木3 種成分含量無顯著差異。

3.4 方法評價

該方法簡便快捷，結果準確可靠，重復性和穩定性均較好，可用于同時測定分心木中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷的含量。