連翹酯苷對(duì)鹽水負(fù)荷模型大鼠的利尿作用*

史向華，薛潤(rùn)苗，牛 丹，史 沁，續(xù) 艷△

（1.山西省藥品審評(píng)中心·山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

連翹是木樨科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實(shí)，有清熱解毒、散結(jié)消腫、清心利尿功效，主治溫?zé)帷⒌ざ尽哒睢b瘍腫毒、瘰疬（淋巴結(jié)結(jié)核）、小便淋閉等證［1］，歷來(lái)有“瘡家圣藥”之稱(chēng)。連翹主產(chǎn)于山西、河南、陜西等地，主要含苯乙醇苷類(lèi)、木脂體及其苷類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、揮發(fā)油等化學(xué)成分。連翹酯苷屬苯乙醇苷類(lèi)，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制彈性蛋白酶活力、解熱等作用［2－4］。本研究中探討了連翹提取物連翹酯苷對(duì)鹽水負(fù)荷模型大鼠的利尿作用，可為其臨床應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CP114 型電子天平（美國(guó)Ohaus 公司）；SB－5200型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；HWS－24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；TgL－18 型高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；AC9801 型電解質(zhì)分析儀（江蘇奧迪康醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）；Cytation5 型多功能微孔讀數(shù)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Histocentre 3 型石蠟包埋機(jī)、Finesse 325 型石蠟切片機(jī)、Excelsior 型全自動(dòng)組織脫水機(jī)（英國(guó)Shandon 公司）；BX53 型熒光顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus 公司）。

試藥：連翹酯苷（筆者自制，含量35.75 mg／mL）；呋塞米（上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1810N13）；0.9% 氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號(hào)為2001122007）；心鈉素（ANP）、抗利尿激素（ADH）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)均為20200525）；Na＋，K＋－ATP酶檢測(cè)試劑盒（金克隆＜北京＞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20200422）；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170924）。

動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，6 周齡，體質(zhì)量180～200 g。購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2017－0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（晉）2017－0001。飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院藥理研究室清潔級(jí)動(dòng)物房。所有大鼠置代謝籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)48 h 后，禁食不禁飲18 h，每只大鼠均按2.5 mL／100 g 灌胃0.9%氯化鈉注射液，使大鼠體內(nèi)水平衡，排盡膀胱內(nèi)余尿，收集2 h 內(nèi)尿液。尿量為給水量的40%以上者為合格［5－7］。

1.2 方法

取模型大鼠40 只，隨機(jī)分為模型組，呋塞米組（0.01 g／kg），以及連翹酯苷高、中、低劑量組（1.5，0.75，0.375 g／kg），各8 只。各給藥組均按5 mL／kg 灌胃，模型組給予等體積水，每日1 次，持續(xù)8 d。末次給藥30 min 后每組均以0.9%氯化鈉溶液3 mL／100 g 灌胃，復(fù)制鹽水負(fù)荷大鼠模型。

1.3 觀察指標(biāo)

累積尿量：大鼠成功建模后立即置代謝籠中，第3，6，12，24 h 分別記錄1 次尿量，并計(jì)算累積尿量。

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：采用電解質(zhì)分析儀檢測(cè)尿液中K＋，Na＋，Cl－含量。累計(jì)尿量3 h 后眼眶靜脈叢采血，分別用肝素鋰和EDTA 采血管收集，4 ℃下3 000 r／min 離心15 min，分離血漿，以ELISA 法測(cè)定ANP，ADH，ACE，AngⅡ，ALD 及Na＋，K＋－ATP 酶含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

組織病理形態(tài)學(xué)：記錄24 h 尿量后，10%水合氯醛麻醉大鼠，摘取左腎（10%中性甲醛液）固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察大鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1至表3。光學(xué)顯微鏡顯示，各組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，無(wú)異常改變，表明各劑量連翹酯苷對(duì)大鼠腎臟組織無(wú)明顯影響。詳見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠累積尿量比較（，mL，n＝8）Tab.1 Comparison of cumulative urine output of rats in each group（，mL，n＝8）

表1 各組大鼠累積尿量比較（，mL，n＝8）Tab.1 Comparison of cumulative urine output of rats in each group（，mL，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。Note：Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01，as well as the following tables.

表2 各組大鼠尿液中電解質(zhì)含量比較（，mmol／L，n＝8）Tab.2 Electrolyte content in the urine of rats in each group（，mmol／L，n＝8）

表2 各組大鼠尿液中電解質(zhì)含量比較（，mmol／L，n＝8）Tab.2 Electrolyte content in the urine of rats in each group（，mmol／L，n＝8）

表3 各組大鼠血漿中ANP，AngⅡ，ACE和Na ＋，K ＋－ATP 酶，ADH，ALD含量比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of the levels of ANP，AngⅡ，ACE and Na ＋，K ＋－ATPase in the plasma of rats in each group（，n＝8）

表3 各組大鼠血漿中ANP，AngⅡ，ACE和Na ＋，K ＋－ATP 酶，ADH，ALD含量比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of the levels of ANP，AngⅡ，ACE and Na ＋，K ＋－ATPase in the plasma of rats in each group（，n＝8）

A.模型組 B.呋塞米組 C.連翹酯苷高劑量組 D.連翹酯苷中劑量組 E.連翹酯苷低劑量組圖1 大鼠腎組織病理切片（HE，×200）A.Model group B.Furosemide group C.Forsythoside high－dose group D.Forsythoside medium－dose group E.Forsythoside low－dose groupFig.1 The pathological section of the renal tissue of the rats（HE，×200）

3 討論

連翹利尿作用顯著［8］，但其利尿成分及作用機(jī)制尚不明確，本研究中建立鹽水負(fù)荷模型大鼠，從大鼠排尿量，尿液電解質(zhì)水平，血漿中ANP，AngⅡ，ACE，ALD，ADH和Na＋，K＋－ATP 酶含量初步探討連翹酯苷的利尿作用機(jī)制。

腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）是人體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)組織和臟器的生理和病理活動(dòng)［9］，還可調(diào)節(jié)人體電解質(zhì)和體液平衡，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。RAAS 主要包括腎素、ACE、血管緊張素酶原和AngⅡ等。其中，ACE 還可刺激腎上腺皮質(zhì)分泌ALD，ALD 進(jìn)入遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞后，加強(qiáng)Na＋重吸收［10－11］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中、低劑量組大鼠3，6 h 累積尿量明顯增多；高劑量連翹酯苷可明顯促進(jìn)尿液中Na＋，K＋，Cl－的排出，高劑量組大鼠尿液中Na＋相比中劑量組有所減少，未造成大量Na＋流失，提示連翹酯苷利尿效果較好，且不會(huì)造成電解質(zhì)紊亂。還可明顯降低AngⅡ，ACE，ALD 減少，表明其可通過(guò)調(diào)節(jié)RAAS，減少AngⅡ和ACE 的分泌，拮抗ALD 分泌，抑制腎小管重吸收，從而促進(jìn)排尿。

ADH 主要作用是增加髓袢升支粗段對(duì)Na＋的重吸收，提高腎遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的通透性，促進(jìn)水的重吸收，是影響體液平衡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素。ANP 具有抑制血管升壓素及血管緊張素、ALD、對(duì)抗腎素－血管緊張素和ADH 的作用，發(fā)揮利鈉、利尿作用［12－13］。本研究結(jié)果顯示，高、中、低劑量組大鼠ADH含量明顯減少，中劑量組大鼠ANP含量明顯增加，表明連翹酯苷可減少ADH，升高ANP，抑制腎遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的重吸收，促進(jìn)尿液排出，而ANP 的增加又可抑制ADH和ALD 的分泌與釋放，阻礙尿液的濃縮過(guò)程，從而進(jìn)一步促使大鼠尿量增多。

Na＋，K＋－ATP 酶主要參與鈉鉀細(xì)胞膜的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，為腎小管重吸收水、離子交換的主要驅(qū)動(dòng)力，具有調(diào)節(jié)腎臟水和電解質(zhì)平衡的功能，其活性直接影響腎小管的重吸收能力［14］。高、中劑量組該酶含量明顯減少，提示連翹酯苷可抑制該酶活性，抑制腎小管重吸收Na＋，促進(jìn)水鈉排泄，同時(shí)可維持電解質(zhì)平衡。

本研究中考慮利尿作用實(shí)驗(yàn)劑量相對(duì)臨床常用劑量明顯提高，發(fā)現(xiàn)各組各指標(biāo)隨著劑量的變化而改變趨勢(shì)不一致，其可能為連翹提取物以連翹酯苷為主，含有多種成分有效部位及具有雙向調(diào)節(jié)作用，隨著劑量的增大，劑量組超出了劑量效應(yīng)，同時(shí)不同劑量影響藥物在體內(nèi)的吸收出現(xiàn)負(fù)反饋，且連翹提取物的利尿作用機(jī)制尚未明確，其相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷對(duì)模型大鼠具有明顯的利尿作用，且各劑量對(duì)大鼠腎臟組織無(wú)明顯影響，表明其可通過(guò)調(diào)節(jié)RAAS 發(fā)揮抑制腎小管重吸收作用，同時(shí)還可增加ANP，減少ADH，抑制Na＋，K＋－ATP酶活性來(lái)促進(jìn)水鈉排泄，從而維持電解質(zhì)和體液平衡，但不引起腎臟組織的變化，這為連翹的利尿作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。