右美托咪定減輕腸缺血再灌注模型大鼠肺損傷機制研究*

盧 燕，何綺霞，陳翠平，朱艷雯，黃家益

（廣東醫科大學附屬醫院麻醉科，廣東 湛江 524001）

腸缺血再灌注損傷是指腸道經過缺血后恢復血流，腸道組織不能恢復正常功能，且加重破壞腸道結構及其功能的病理過程［1］，可導致全身多個組織及器官受損，其中以肺最明顯，可能與腸道缺血再灌注損傷時釋放出的白細胞介素6（IL－6）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性介質相關，可引起結構及功能破壞，導致肺毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞損傷，最終導致急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征等［2－3］。李徽徽等［4］已證實，高遷移率族蛋白1（HMGB1）／Toll 樣受體4（TLR4）／核因子－κB（NF－κB）信號通路參與腸缺血再灌注導致組織損傷。右美托咪定屬α2腎上腺素能受體激動劑，可保護缺血再灌注受損器官［5－6］。HMGB1／TLR4／NF－κB 信號通路是否在右美托咪定預處理抑制腸缺血再灌注誘導的肺損傷中發揮作用尚未清楚，本研究中對此進行了探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Eppendorf 管、5417R 型和5810R 型離心機（德國Eppendorf 公司），Sartorius BT223 型天平（賽多利斯科學儀器公司），DYY－8 型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠），JS－300 型凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司），PTC－100 型PCR 儀（美國PE 公司）。

試藥：右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥公司，批號為170518BP）；一氧化氮（NO）試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（武漢博士德生物有限公司，批號為A00368）；HMGB1、TLR4、NF－κB 抗體（美國Biotech 公司，批號為19811－1－AP）；DAB、蛋白酶K（美國Biovision 公司，批號為9210－100）；HRP 溶液、TdT 酶反應液（德國 Boechringer Mannheim 公司，批號為abx232556）；2%戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司）。

動物：健康雄性SPF 級SD 大鼠30 只，15 周齡，購自廣東醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（粵）2018－0008，體質量（285±25）g。于動物實驗中心適應性飼養1 周。

1.2 方法

1.2.1 分組建模與給藥

取SD 大鼠30 只，按隨機數字表法分為對照組、模型組、觀察組，各10 只。在行腸道缺血手術前，模型組、觀察組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg／kg，麻醉完成后從腹部正中切開、鈍性分離、暴露腸系膜上動脈，用無創血管夾夾閉大鼠腸系膜上動脈60 min 后松夾再灌注60 min，以復制腸缺血再灌注大鼠模型。對照組僅開腹120 min，不夾閉腸系膜上動脈。觀察組在夾閉動脈前10 min 尾靜脈注射右美托咪定5 μg／kg，對照組及模型組均給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 樣本采集與檢測

血清炎性細胞因子：大鼠于實驗結束后取血，4 ℃下、3 000 r／min 離心10 min，收集上清液，分裝至無菌的Eppendorf 管，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測TNF－α，白細胞介素1（IL－1）和HMGB1 水平。

肺組織病理形態學：處死大鼠，開胸，取左、右肺，在冰鹽水中漂洗干凈，將左下肺置10 倍體積10%中性甲醛中固定，然后常規行組織石蠟包埋、切片及蘇木素－伊紅（HE）染色。

肺組織勻漿中NO 及NOS 水平：稱取大鼠肺組織，0 ℃下以0.9%氯化鈉溶液制備5%肺組織勻漿，37 ℃水浴20 min，檢測NO 及NOS 水平。

肺組織濕干質量比（W／D）：剖胸，取出大鼠右肺，立即用濾紙拭干肺組織表面水分、血液，用天平稱得其質量，即得濕質量（W），將肺組織放入80 ℃烤箱烘烤48 h，再用天平稱得其質量，即得干質量（D），計算W／D。

肺組織勻漿中HMGB1，TLR4，NF－κB 蛋白表達：采用Western blotting 法將肺組織、裂解液混合物置勻漿器中，充分研磨，冰上裂解30min，3000r／min 離心15min，收集上清液，以BCA 法檢測蛋白含量。常規電泳、轉膜、孵育，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBS 緩沖液洗滌3 次，加入相應二抗，室溫孵育2 h，常規顯影。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肺組織病理形態學

模型組大鼠肺組織結構嚴重破壞，肺泡腔內可見大量炎性細胞滲出，肺間質彌漫性水腫、出血，觀察組大鼠肺組織僅少許炎性細胞滲出及出血。詳見圖1。

2.2 血清炎性因子水平

A.對照組 B.模型組 C.觀察組圖1 3組大鼠肺組織形態學改變（HE，×200）A.Control group B.Model group C.Observation groupFig.1 Morphological changes of lung tissue of rats in the three groups（HE，×200）

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF－α，IL－1，HMGB1 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組大鼠上述指標水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 3組大鼠炎性因子水平比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of the inflammatory factors levels in the three groups（，n＝10）

表1 3組大鼠炎性因子水平比較（，n＝10）Tab.1 Comparison of the inflammatory factors levels in the three groups（，n＝10）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。表2、表3 同。Note：Compared with those in the control group，aP＜0.05；compared with those in the model group，bP＜0.05；as well as Tab.2 and Tab.3.

2.3 肺組織NO，NOS 水平及W／D

與對照組比較，模型組大鼠肺組織NO，NOS 水平及W／D 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，觀察組大鼠前述指標均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 3組大鼠肺組織NO，NOS 及W／D 比較（，n＝10）Tab.2 Comparison of NO，NOS and W／D in lung tissues of rats in the three groups（，n＝10）

表2 3組大鼠肺組織NO，NOS 及W／D 比較（，n＝10）Tab.2 Comparison of NO，NOS and W／D in lung tissues of rats in the three groups（，n＝10）

2.4 肺組織中蛋白表達水平

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中HMGB1，TLR4，NF－κB 蛋白表達水平均顯著升高；與模型組比較，觀察組上述蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

表3 3組大鼠肺組織中蛋白表達水平比較（，n＝10 ）Tab.3 Comparison of protein expression levels in lung tissues of rats in the three groups（，n＝10 ）

表3 3組大鼠肺組織中蛋白表達水平比較（，n＝10 ）Tab.3 Comparison of protein expression levels in lung tissues of rats in the three groups（，n＝10 ）

圖2 3組大鼠肺組織中蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels in lung tissues of rats in the three groups

3 討論

腸缺血再灌注發生后，其上皮通透性增加、水腫，黏膜屏障遭到破壞，甚至進展為腸源性敗血癥，嚴重時可危及生命［7－8］。既往研究證實，腸缺血再灌注可引起腸道損傷，本研究結果顯示，模型組大鼠血清炎性因子水平較對照組升高，而觀察組較模型組降低，說明腸缺血再灌注損傷可導致血清炎性因子大量釋放，并且腸缺血再灌注不僅損傷腸道周圍組織及器官，還可引起肺的急性炎性反應，從而導致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［9－10］。腸缺血再灌注時釋放的內毒素和細胞因子還可誘導肺內皮細胞和巨噬細胞產生，釋放NO 及NOS［11］。本研究中，模型組大鼠肺組織勻漿中NO和總NOS 水平均有升高，W／D 顯著增高，提示腸缺血再灌注誘發了大鼠肺組織炎性反應，導致急性肺損傷，而觀察組上述指標顯著降低；肺組織病理形態學顯示，模型組大鼠肺組織結構被嚴重破壞，肺泡腔內可見大量炎性細胞滲出，肺間質彌漫性水腫、出血，而觀察組肺組織僅有少許炎性細胞滲出及出血，說明右美托咪定能減輕腸缺血再灌注模型大鼠肺損傷的炎性反應。

已有實驗證實，HMGB1／TLR4／NF－κB 信號通路與腸缺血再灌注損傷關系密切［12－13］，當發生腸缺血再灌注損傷時，HMGB1 與TLR4 受體結合后激活NF－κB啟動與調節與免疫、炎性反應相關的基因表達，導致炎性因子釋放及組織與器官損傷［14］。而右美托咪定可通過抑制HMGB1／TLR4／NF－κB 信號通路減輕心肌［15］、脊髓［16］及腦［17］缺血再灌注損傷。本研究結果顯示，腸缺血再灌注后模型組大鼠肺組織勻漿中HMGB1，TLR4，NF－κB 表達水平均升高，而觀察組上述各指標表達水平下降，提示腸缺血再灌注誘導肺損傷時HMGB1 ／TLR4 ／NF－κB 信號通路被激活，右美托咪定可減輕腸缺血再灌注模型大鼠肺損傷與該信號通路有關。

右美托咪定屬α2受體激動劑，通過與α2受體結合而發揮抑制交感神經及刺激迷走神經的雙重作用，并兼具鎮靜、鎮痛、抗炎等作用［18］，臨床用于蘇醒期鎮靜、術后鎮痛、延長神經阻滯時間、圍術期器官保護等［19－21］，近年來學者關注其抗炎及保護缺血再灌注器官的作用［6］。本研究結果顯示，腸缺血再灌注后給予右美托咪定，模型大鼠肺組織病理結構得到明顯改善，血清炎性因子水平，以及肺組織勻漿中NO，NOS 水平，W／D和HMGB1，TLR4，NF－κB 蛋白表達水平均顯著降低。

綜上所述，右美托咪定預處理可減輕腸缺血再灌注模型大鼠急性肺損傷狀態，其機制與抑制HMGB1／TLR4／NF－κB 信號通路有關。