miRNA-122-5p對細胞色素 P450 3A4調控替格瑞洛代謝細胞學研究

才 藝， 趙曉杰， 張效林， 劉 丹， 田孝祥， 閆承慧

北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016

替格瑞洛是我國當前使用較為普遍的抗血小板藥物[1-2]，主要經細胞色素 P450 3A4(cytochrome P450 3A4，CYP3A4)代謝，少部分經CYP3A5代謝，其主要代謝產物為AR-C124910XX。體外實驗表明，活性代謝產物具有活性，可與血小板P2Y12ADP 受體結合，達到抗血小板作用，活性代謝物的全身暴露量約為替格瑞洛的30%～40%[3-6]。細胞色素P450具有表型多態性與基因多態性的特點，是造成個體藥物代謝差異性的主要原因，其中,CYP3A4參與多種藥物的代謝過程[7-8]。CYP3A4的表達主要取決于其細胞中微小RNA(microRNA,miRNA)的水平。有研究證實，miR-122-5p在肝組織中大量表達,可作為丙型肝炎病毒相關肝細胞癌的診斷生物標志物，用于診斷肝細胞癌癥等作用[9-13]。miR-122-5p對CYP3A4表達具有特異性調控[14-15]，但miR-122-5p對CYP3A4的調控是否與替格瑞洛的代謝存在相關性尚待證實。本研究旨在探討miRNA-122-5p 是否通過特異性調控CYP3A4的表達，從而影響替格瑞洛的代謝。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和刺激 人正常肝細胞(human normal liver cell，LO2)維持在補充有10% FBS 的 DMEM中，溫度為37℃，濕度為5% CO2。采用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen,Carlsbad，CA)，按照制造商方案將miRNA模擬物(100 nmol/L)、miRNA抑制劑(100 nmol/L)及其對照轉染到LO2中。轉染后36 h，收集LO2。在miR-122-5p模擬物和miR-122-5p抑制劑轉染后，LO2用5 μmol/L替格瑞洛刺激24 h。

1.2 蛋白質印跡法 在轉染和處理后，收集6孔板中的細胞，并在冰上用蛋白裂解液制備全細胞裂解物。蛋白質濃度用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒(Boster)測定。全細胞蛋白質(20 μg)在SDS-PAGE上分離并電泳轉移到聚偏二氟乙烯膜上。膜與選擇性兔抗人CYP3A4多克隆抗體孵育，隨后用二抗孵育。使用化學發光試劑使條帶在暗室處曝光可視化。利用Imag J對條帶進行灰度分析。

1.3 RNA提取 使用TRIzol試劑提取總RNA。使用逆轉錄試劑盒和特定的逆轉錄引物(RiboBio)將總 RNA(2 μg)逆轉錄為 cDNA。使用 KAPA SYBR?FAST qPCR 試劑盒(Kapa Biosystems，Wilmington，USA)和特異性引物(RiboBio)在 7900HT 快速實時PCR系統(Applied Biosystems)上進行定量PCR。U6 miRNA用作miR-122-5p的內標，GAPDH用作CYP3A4的內標。每個反應重復3次，分析采用 2-ΔΔCt法。

1.4 液質聯用檢測培養基中替格瑞洛及其代謝物AR-C124910XX含量 準確量取培養基200 μl，加入300 μl三氯甲烷-水溶液(2∶1)和200 μl乙腈，加入10 μl(500 ng/ml替格瑞洛-d7)內標液，渦旋混勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μl至35℃的氮氣流下干燥，將每個殘留物重新溶解在 50 μl乙腈-水(1∶1)中，以12 000 r/min離心20 min，取上清液進行UPLC-MS/MS檢測。色譜條件：色譜柱UPLC HSS C18柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40℃，流動相：0.2%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)組成，流速設置為0.25 ml/min。正離子模式下的多反應監測。參數如下：ESI正電離模式，錐孔電壓為40.0 V，毛細管電壓為3.2 kV，去溶劑化溫度為450℃，離子源溫度為100℃。去溶劑化、錐孔氣體(氮氣)的流速分別為600、50 L/h。用于定量的離子對為替格瑞洛m/z 523.19～m/z 127.10，內標替格瑞洛-d7 m/z 530.23～m/z 127.1；AR-C124910XX m/z 479.18～m/z 153.06。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行處理。采用Pearson 法進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-122-5p模擬物和抑制劑轉染后改變LO2中miR-122-5p表達 在體外培養的LO2中分別轉染miR-122-5p模擬物和抑制劑后，通過實時聚合酶鏈反應檢測miR-122-5p的表達情況。結果證實，與miR-122-5p模擬物陰性對照組相比較，miR-122-5p模擬物組轉染后顯著增加LO2中miR-122-5p表達(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對照組相比較，miR-122-5p抑制劑組顯著下調了LO2中miR-122-5p表達(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同轉染組miR-122-5p的mRNA水平

2.2 miR-122-5p調控LO2中CYP3A4的蛋白表達 miR-122-5p 模擬物和抑制劑轉染后，檢測LO2中CYP3A4的蛋白表達情況。Western Blot和定量分析證實，與miR-122-5p模擬物陰性對照組相比，miR-122-5p模擬物組CYP3A4的表達顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對照組相比，miR-122-5p抑制劑組CYP3A4的表達顯著增加(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同轉染組CYP3A4的蛋白表達水平(a.CYP3A4與GAPDH的代表性蛋白質印跡圖像；b.CYP3A4/GAPDH灰度值定量分析)

2.3 miR-122-5p下調LO2中CYP3A4的mRNA表達 在轉錄水平上，與miR-122-5p模擬物陰性對照組相比，miR-122-5p模擬物組CYP3A4的表達顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對照組相比，miR-122-5p抑制劑組CYP3A4的表達顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同轉染組CYP3A4的mRNA水平

2.4 miR-122-5p調控CYP3A4的表達影響替格瑞洛的濃度 與miR-122-5p模擬物陰性對照組相比，miR-122-5p模擬物組中細胞培養基中替格瑞洛濃度增高，其活性代謝物AR-C124910XX的濃度顯著降低(P<0.05)。與miR-122-5p抑制劑陰性對照組相比，miR-122-5p抑制劑組中細胞培養基中替格瑞洛濃度降低，其活性代謝物AR-C124910XX的濃度顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同轉染組細胞培養基中替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX的濃度(a.不同轉染組細胞培養基中替格瑞洛的濃度；b.不同轉染組細胞培養基中活性代謝物AR-C124910XX的濃度)

2.5 miR-122-5p-CYP3A4表達變化與替格瑞洛的代謝相關性 以CYP3A4相對蛋白表達為因變量，替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX的濃度為自變量進行Pearson相關性分析，結果表明，替格瑞洛的濃度與CYP3A4的相對蛋白表達呈負相關(r=-0.888，P<0.05)，活性代謝物AR-C124910XX與CYP3A4的相對蛋白表達呈正相關(r=0.727，P<0.05)。替格瑞洛及活性代謝物AR-C124910XX濃度與CYP3A4相對蛋白表達的散點圖見圖5。

圖5 CYP3A4/GAPDH表達與替格瑞洛及其活性代謝物AR-C124910XX濃度相關性散點圖(a.CYP3A4/GAPDH表達與替格瑞洛濃度相關性散點圖；b.CYP3A4/GAPDH表達與活性代謝物AR-C124910XX濃度相關性散點圖)

3 討論

本研究采用LO2進行轉染實驗，應用實時聚合酶鏈反應技術檢測轉染后細胞中miR-122-5p水平，結果表明，miR-122-5p的模擬物和抑制劑能夠改變LO2中miR-122-5p水平。本研究應用蛋白印記技術和實時聚合酶鏈反應技術檢測轉染后LO2中CYP3A4的蛋白表達和轉錄水平，結果表明，miR-122-5p在蛋白表達和轉錄水平上抑制CYP3A4的表達。對轉染后的LO2加替格瑞洛(5 μmol/L)刺激24 h，利用高效液相質譜聯用技術檢測細胞培養基中替格瑞洛及其代謝物AR-C124910XX的濃度，結果表明，與miR-122-5p模擬物陰性對照組比較，細胞培養基中替格瑞洛的濃度升高，活性代謝物AR-C124910XX降低；與miR-122-5p抑制劑陰性對照組比較，細胞培養基中替格瑞洛的濃度降低，活性代謝物AR-C124910XX的濃度升高。本研究采用Pearson相關性分析檢驗miR-122-5p-CYP3A4表達變化與替格瑞洛的代謝相關性，結果表明，細胞培養基中替格瑞洛的濃度與CYP3A4表達呈負相關，活性代謝物AR-C124910XX與CYP3A4表達呈正相關。miR-122-5p通過調控CYP3A4的表達進而影響替格瑞洛的代謝。

CYP3A4的基因多態性是對藥物代謝影響的重要原因。Gill等[14]應用螢光素酶報告基因分析證實了miR-122-5p與CYP1A2和CYP3A4的3′UTR之間的相互作用，miR-122-5p在細胞中的過表達對CYP3A4具有抑制作用。Holmberg等[16]研究結果表明，CYP3A4*22等位基因顯著降低替格瑞洛的消除，從而增強其抗血小板作用。CYP3A4的特異性表達與替格瑞洛的代謝具有相關性。本研究存在一定的局限性，由于研究時間短，未收集服用替格瑞洛的急性冠狀動脈綜合征患者的血漿樣本，對血漿中的miR-122-5p進行分析，沒有結合臨床患者用藥后的藥物代謝情況，具體機制還需進一步大樣本及隨訪研究驗證。

綜上所述，miR-122-5p通過調控CYP3A4的表達進而影響替格瑞洛的代謝。替格瑞洛是治療急性冠狀動脈綜合征的重要藥物，深入探討藥物代謝的影響對臨床合理用藥和疾病發展的研究提供了研究基礎。