人主動脈平滑肌細胞體外分離及培養

王 靜， 李逸明， 劉 丹， 宋海旭， 閆承慧， 田孝祥

1.北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016；2.錦州醫科大學研究生院，遼寧 錦州 121001

主動脈疾病包括主動脈夾層和主動脈瘤破裂，急性起病時院內死亡率超過60%[1]。主動脈包括內膜、中膜及外膜三層結構。主動脈平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)主要位于中膜，是主動脈數量最多的細胞類型之一，對維持主動脈結構和功能完整至關重要[2]。但人主動脈組織難以獲得，多數研究采用小鼠或大鼠來源的主動脈SMC替代[3]。這一做法的缺點是忽略了人與嚙齒類動物的種屬差異，導致很多動物實驗結果不能解釋人主動脈疾病的發病機制[4]。目前，關于小鼠和大鼠主動脈SMC體外培養的報道較多，而對人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cell，HAoSMC)的分離及培養的研究較少[5]。本研究旨在探討HAoSMC的體外分離及培養方法，為闡明主動脈疾病的發病機制奠定基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人升主動脈組織取自在北部戰區總醫院接受外科主動脈置換手術的A型主動脈夾層患者。Ⅱ型膠原酶、100×抗生素溶液(每ml含10 000 U青霉素、10 mg鏈霉素、25 μg兩性霉素B)購自美國Sigma Aldrich公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培養基、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠二抗購自美國Thermo Fisher公司；小鼠抗SM α-actin及SM 22α一抗購自美國Abcam公司；一次性細胞培養皿及培養板購自美國Invitrogen公司。本研究方案獲得北部戰區總醫院倫理委員批準，且患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 分離人主動脈中膜 將術中得到的人主動脈組織置于含冰的無菌生理鹽水50 ml離心管中，然后將其轉移至超凈臺中操作。用無菌鑷子夾取主動脈組織至10 mm細胞培養皿中，用含有1×抗生素的冰的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗3遍。用彎鑷撕掉主動脈內膜，保留中膜。將中膜轉移到含有10% FBS的高糖DMEM培養基中，用眼科剪將中膜剪成約2 mm寬的組織條，再將組織條剪成約2 mm長的小塊。將組織塊轉移至50 ml離心管中，靜置沉淀。移除培養基。

1.2.2 Ⅱ型膠原酶消化人主動脈中膜并分離SMC 將Ⅱ型膠原酶粉末溶于含10% FBS的DMEM培養基中，使其終濃度為0.15%。用0.2 μm濾器過濾除菌。將沉淀的主動脈中膜組織塊重懸于6 ml 0.15% Ⅱ型膠原酶消化液中，并將其轉移到10 mm細胞培養皿中。將培養皿置于37℃、5% CO2培養箱中消化。每小時在顯微鏡下觀察消化效果。消化10 h時，終止消化，用1 ml移液槍頭反復吹打組織塊，直至細胞脫落，組織塊明顯變小或消失。

1.2.3 培養分離所得SMC 將消化并吹打后的培養液收集至15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清。重懸于含20% FBS及1×抗生素的高糖DMEM培養基中，并用移液管輕輕吹打，使其成為細胞懸液。將細胞懸疑接種于1個6孔板中，每孔2 ml。1 d后于顯微鏡下觀察細胞生長情況，以后每天觀察1次。第3、7、14天時在倒置相差顯微鏡下拍照記錄細胞生長情況。第3天時首次換液，去除未貼壁細胞或組織塊。以后根據細胞生長情況每3～5 d換液1次。

1.2.4 HAoSMC免疫熒光染色 將無菌蓋玻片置于24孔板中，每孔加入1 ml含20% FBS及1×抗生素的高糖DMEM培養基。取50 μl細胞懸液，加入1 ml培養基中制備細胞爬片。培養第14天吸棄培養基，PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3遍。0.1% Triton X-100通透5 min。PBS洗3遍。5%山羊血清封閉30 min。將小鼠抗SM α-actin及SM 22α一抗(1∶100稀釋)分別加到細胞爬片上，4℃孵育過夜。PBS洗3遍。將山羊抗小鼠熒光二抗(1∶100稀釋)加到細胞爬片上，室溫避光孵育30 min。PBS洗3遍。用0.5 μg/ml DAPI染核1 min。PBS洗3遍。防淬滅熒光封片劑封片。正置熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

2 結果

2.1 成功獲得人主動脈中膜組織 獲得的人主動脈標本中可見內膜、中膜及外膜，且在中膜外側可見主動脈夾層中形成的血栓(圖1a)。主動脈的中膜與內膜貼在一起，用鑷子可將內膜完整的剝除，保留中膜(圖1b)。通過眼科剪可將主動脈中膜剪成均一的寬度約2 mm的組織條(圖1c)。進一步將組織條剪碎，可獲得約2 mm×2 mm大小的組織塊(圖1d)。

圖1 人主動脈中膜組織分離及處理

2.2 Ⅱ型膠原酶成功消化人主動脈中膜組織塊 0.15%Ⅱ型膠原酶消化到10 h時，鏡下可見組織塊變疏松，組織塊中可分辨出葡萄串樣細胞團。此時終止消化，吹打組織，可見消化之前致密均一的白色中膜組織塊基本消失，僅剩少量體積較小、較疏松的白色組織塊懸浮于膠原酶中。見圖2。

圖2 人主動脈中膜組織的膠原酶消化

2.3 HAoSMC培養時的生長特點 在培養1 d時，顯微鏡下可見貼壁的圓形單個細胞及細胞團；還可見懸浮于培養基中的無細胞基質團塊，即SMC從中膜分離之后殘留的血管基質骨架。該團塊不貼壁，后續可通過更換培養液去除，對細胞生長無影響。在培養3 d時，貼壁細胞展開，從最初的圓形變成梭形。在培養7 d時，大部分貼壁細胞呈長梭形，細胞數量增多。在培養14 d時，細胞數量進一步增加，基本達到融合狀態。見圖3。

圖3 不同時間點HAoSMC生長特點(200倍)

2.4 體外培養HAoSMC標志物染色陽性 對培養14 d的HAoSMC進行SMC標志物SM α-actin及SM 22α免疫熒光染色，發現兩種標志物染色均為陽性。SM α-actin及SM 22α主要呈細絲狀分布于細胞內。見圖4。

圖4 HAoSMC SM α-actin及SM 22α免疫熒光染色(200倍)

3 討論

在主動脈疾病的基礎研究中，多采用小鼠或大鼠主動脈進行SMC分離培養[3，6]。這樣做有以下優勢：(1)小鼠及大鼠主動脈容易獲取，可大量制備；(2)小鼠及大鼠個體差異小，一致性好；(3)小鼠及大鼠主動脈較薄，易處理。但有研究發現，HAoSMC與小鼠、大鼠主動脈SMC具有顯著的種屬差異[4]，對相同的病理刺激可表現為完全不同的生物學行為[7]。因此，大鼠及小鼠主動脈來源的SMC不能替代HAoSMC在主動脈疾病研究中的地位。目前，HAoSMC分離及培養困難主要有以下3個原因：(1)人主動脈來源極其困難，研究人員很難獲得正常人的主動脈作為對照，僅能從接受主動脈置換手術的主動脈夾層或破裂的主動脈瘤患者中獲得主動脈組織；(2)接受手術的主動脈夾層或主動脈瘤患者大多年齡較大，且存在高血壓等多種危險因素，因此，分離得到的細胞易于衰老，個體差異大；(3)人主動脈中膜厚且致密，SMC很難從中遷移出來。

本研究從人主動脈夾層標本中分離出主動脈中膜，這一過程需注意以下4點：(1)原代取材的組織要特別注意防止細菌及真菌污染。本研究在獲得組織后，采用含有抗生素的無菌PBS清洗3遍，并在培養基中添加抗生素，抗生素中不僅含有針對細菌的青鏈霉素，還有針對真菌的兩性霉素B。(2)保持細胞活性。本研究在酶消化之前，均采用冰的緩沖液處理組織，以降低細胞代謝過程中的氧化應激損傷。(3)熟練掌握主動脈解剖結構，準確區分外膜及內膜。在剝離內膜時，用鑷子撕除即可，不需用剪刀或手術刀銳性分離。(4)在小鼠及大鼠主動脈SMC分離時，要將主動脈組織塊剪成或切成1 mm3的小塊，但在實際操作中，人的主動脈中膜很難達到這一要求。因為小鼠主動脈中膜約50～100 μm厚，由6～8層SMC及彈力板構成[8-9]；大鼠主動脈中膜約100～150 μm厚，由8～10層SMC及彈力板構成[10-11]；而人主動脈中膜厚達2～4 mm，由40～50層SMC及彈力板構成[12]。因此，與薄而軟的小鼠或大鼠主動脈相比，人主動脈中膜組織厚而致密，韌性很大，很難剪小。

本研究采用膠原酶消化法對HAoSMC進行分離培養。對小鼠及大鼠的主動脈SMC分離培養主要有貼塊及酶消化兩種方法[13-14]。(1)貼塊法[15]：將剪碎的主動脈中膜組織塊直接置于培養皿中，保持靜止不動，使組織塊貼在培養皿底，SMC將在2～3周內從組織塊中遷移出來，生長于培養皿底。該方法培養的細胞活性較好、數量多，但需要時間較長。此外，培養過程中對培養皿的輕微晃動可造成組織塊脫落，導致培養失敗。(2)酶消化法[16]：采用膠原酶、彈性蛋白酶等將中膜組織中的SMC分離出來。該方法分離時間短，僅需24 h即可獲得貼壁細胞。由于分離時間短，分離的細胞更貼近在體時的表型。缺點是細胞量較貼塊法少。本實驗室曾成功用上述兩種方法分離得到小鼠及大鼠主動脈SMC。但在嘗試采用貼塊法分離培養HAoSMC時均以失敗告終(未獲得細胞)。分析原因，可能與人主動脈中膜厚而韌，難以剪成小組織塊，導致組織塊不易貼壁、SMC不易從組織塊中遷移出來有關。本研究采用的Ⅱ型膠原酶濃度為0.15%，孵育條件為37℃ 10 h。酶濃度及消化時間差異較大，可能原因如下：(1)酶的生產商和品質不同，保存條件也不同，導致酶的活性差異較大；(2)人主動脈組織來源于不同性別、年齡、人種、疾病狀態的患者，導致HAoSMC生物學特性差異較大[17-18]，影響分離及培養效果。由上可知，即使在消化酶得到良好質控的情況下，主動脈組織的差異也會使HAoSMC的分離培養難有統一標準。因此，在實際研究工作中，應根據患者的不同臨床特征，總結HAoSMC分離培養方法的差異和經驗。

本研究在接種細胞前未用細胞濾網過濾細胞懸液。細胞濾網的作用是將未消化完全的組織塊過濾掉，缺點是可能過濾掉細胞團，降低收獲的數量[5]。本研究未用濾網，在接種1 d時發現單個及細胞團均有貼壁，而未過濾掉的大的懸浮團塊為無細胞的基質成分，在換液時可輕松棄掉，對細胞生長無影響。在后續的時間點，發現細胞團貼壁后細胞增殖優于單個細胞貼壁。因此，分離HAoSMC時，在充分消化的基礎上，不使用細胞濾網可能得到優于使用濾網的效果。

本研究系統觀察了HAoSMC的生長特性及標志物表達，結果顯示：1 d時細胞貼壁，7 d時細胞成典型的長梭形，14 d時細胞基本達到融合狀態；SM α-actin及SM 22α染色均為陽性，且主要呈細絲狀分布于細胞內。與既往研究[19-20]一致。

綜上所述，本研究采用酶消化法成功從主動脈夾層患者標本中分離并培養出HAoSMC，為進一步闡明主動脈疾病的發病機制奠定了基礎。