趨化因子CCL21基因 rs2812377單核苷酸多態位點與急性心肌梗死發病相關性分析

張文旭， 姜金萍， 程茗慧， 張效林

北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種常見、多發的心血管疾病，發病率及病死率較高，是常見的心血管疾病死亡原因之一[1-2]。有研究發現，炎癥在AMI后繼發的心肌組織損傷中發揮重要作用。冠狀動脈粥樣硬化的斑塊組織破裂，繼發斑塊核心區域脂質大量釋放入血，激活血液中血小板和凝血因子，罪犯血管的血栓組織形成。在此過程中，炎癥繼發的細胞因子、趨化因子在病灶區域的活化和聚集引起病灶部位的炎癥級聯放大效應中發揮重要作用，導致病灶部位心肌組織缺血、壞死[3-4]。趨化因子作為一種小分子量蛋白質，可以引起炎癥的級聯放大效應，加劇動脈粥樣硬化的進展及心肌梗死后心肌細胞的變性、壞死，趨化中性粒細胞等炎癥細胞到達病變部位，通過炎癥反應造成病變部位損傷[5]。經典的趨化因子可以分為C、CC、CXC和CX3C四個家族。CCL21作為趨化因子CC家族的重要成員，在動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞、平滑肌細胞和內皮細胞中大量表達。同時，CCL21能夠趨化單核細胞和內皮細胞的粘附效應，加劇動脈粥樣硬化不穩定斑塊炎癥反應進程[6-7]。目前，CCL21與AMI發病的相關性研究少見報道。本研究旨在探討AMI患者血清中CCL21的表達水平，以及CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點與AMI發病的相關性。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2012年4月至2018年10月北部戰區總醫院心血管內科收治的253例AMI患者納入B組。納入標準：年齡45～75歲者；24 h內出現過急性胸痛癥狀者；診斷符合美國心臟病學學會/美國心臟協會標準關于AMI標準者；入院后血清心肌酶譜出現動態演變者；典型胸痛癥狀持續時間>30 min者；入院后心電圖呈動態演變，心電圖至少有兩個肢體導聯ST段抬高≥0.1 mV，或胸前導聯ST段抬高0.2 mV，或有新發生的左束支傳導阻滯者。另選取211例同期住院且冠狀動脈造影顯示冠狀動脈的狹窄程度≤20%者納入A組。本研究經醫院倫理委員會審批。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 記錄所有研究對象年齡、性別、體質量、高血壓、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、吸煙等一般資料。記錄患者的血清生化指標及心肌酶學動態變化情況，以及AMI患者的心電圖的動態演變情況。清晨采集研究對象空腹外周靜脈血5 ml，EDTA-Na2進行抗凝，-20℃冰箱儲存。

1.3 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附實驗檢測血清中CCL21濃度。繪制標準曲線，將待檢測的血漿標本原液或者稀釋1倍的稀釋液加入待檢測的反應板孔內，室溫25℃反應1 h后洗滌反應檢測板，每個孔內加入100 μl HRP標記的抗CCL21抗體工作液，室溫25℃放置檢測板1 h，洗板，加入100 μl顯色，25℃ 20 min孵育后，加入終止液體，450 nm單波長檢測待檢孔的吸光度值，計算待檢測樣品的濃度。

1.4 DNA提取 將5 ml EDTA抗凝血倒入15 ml尖頭離心管中，3 000 r/min、4℃離心10 min，將收集的血液上清分離，-80℃低溫冰箱凍存。在收集上清后的尖頭離心管中加入紅細胞裂解液10 ml，冰上裂解15 min，3 000 r/min、4℃離心10 min。加入50 μl蛋白酶K(10 mg/ml)和10% SDS 0.5 ml室溫消化，反復離心、洗滌后挑出DNA沉淀，去除RNA酶，室溫溶解。

1.5 基因分型 采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀，通過iPLEX化學分析對CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點的基因分型進行分析。該分析方法遵循標準的Sequenom程序，CCL21基因型的分析由北京博淼生物科學技術有限公司完成。

2 結果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象年齡、男性比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。B組高血壓比例、吸煙比例、體質量指數、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇高于A組，高密度脂蛋白膽固醇低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象基因型分析 CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點3種基因型TT型、GT型、GG型在A組和B組中的分布頻率分別為47例(22.3%)、92例(43.6%)、72例(34.1%)和37例(14.6%)、115例(43.9%)、101例(41.5%)。CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點T、G等位基因在A組和B組中的分布頻率分別為186例(44.1%)、236例(55.9%)和185例(36.6%)、321例(63.4%)。兩組基因型TT型、GT型、GG型分布頻率和等位基因T、G分布頻率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點G等位基因是AMI發病的獨立危險因素(比值比=1.36，95%可信區間1.05～1.77，P<0.05)。

2.3 兩組研究對象血漿CCL21表達水平比較 B組血漿中CCL21水平為(889.78±268.98)pg/ml，明顯高于A組的(516.52±186.01)pg/ml，差異有統計學意義(P<0.05)。B組GG型、GT型、TT型血漿CCL21表達水平均高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組GG型、GT型血漿CCL21表達水平均高于TT型，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血漿CCL21表達水平比較

3 討論

AMI在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎上發生。粥樣硬化斑塊內部的炎癥負荷、脂質負荷超過粥樣硬化斑塊纖維帽的承載能力，粥樣硬化的薄纖維帽破裂，粥樣硬化斑塊釋放炎癥介質及脂質成分，激活機體血液中的血小板及纖維蛋白原等發生凝血瀑布效應，最終導致罪犯血管的血栓形成，造成罪犯血管病變部位的心肌組織缺血、壞死。有研究表明，炎癥在AMI發生過程中發揮重要的作用[8-9]。

本研究對CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點與AMI的相關性進行分析，結果發現，CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點與AMI相關；進一步分析發現，CCL21 rs2812377不同基因型攜帶者血漿中CCL21表達水平存在差異，提示CCL21基因rs2812377 G等位基因是AMI的獨立危險因素，其發病風險為正常者的1.36倍。CCL21位于人類9號染色體的p13.3，是能夠編碼110個氨基酸的小分子量蛋白質。CCR7受體是趨化因子CCL21的主要結合受體，其與經典的趨化因子受體結構相似，是具有7次跨膜結構域的G蛋白耦聯受體，分子量組成為378個氨基酸。CCR7基因位于17號染色體q12-q21.2區域。趨化因子CCL21通過與CCR7結合引起病變組織炎癥級聯反應[10]。CCR7主要在胸腺的T細胞和B細胞中表達，在機體的免疫炎癥反應調節中發揮重要作用，CCR7通過與其配體CCL21結合，誘導免疫細胞的成熟與分化。動脈粥樣硬化的形成是AMI發病的重要病理進程[11-12]。有研究報道，趨化因子CCL21與其受體CCR7結合后，可誘導動脈粥樣硬化炎癥反應，同時惡化動脈粥樣硬化病變的反應過程[13-16]。但另有研究發現，CCL21與CCR7結合后，可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的進程[17]。以上研究結果不一致的原因可能為研究者選擇的動脈粥樣硬化模型不同[3]，也可能為動物飼養的過程中，飲食、環境、氣候的細微差別造成的研究結果不同。

綜上所述，CCL21基因rs2812377單核苷酸多態位點與AMI發生相關，CCL21基因 rs2812377可以作為AMI的生物標志物。