外源褪黑素對鹽脅迫下棉花幼苗生長及光合特性的影響

李 陽，陳 靜，劉紹東，沈 倩，張思平，葛常偉，劉瑞華， 馬慧娟，萬素梅，龐朝友

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.棉花生物學國家重點實驗室中國農業科學院棉花研究所，河南安陽 455000)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花種植面積以及產量均居全國首位[1]。鹽堿化給新疆的農業生產帶來了挑戰[2]。在棉花種子萌發及幼苗時期對逆境脅迫最為敏感[3]。在實際農業生產過程中，通過噴施外源調節劑等對棉花幼苗進行抗逆鍛煉緩解鹽脅迫的危害尤為重要。【前人研究進展】鹽脅迫顯著抑制棉花幼苗的生長以及干物質積累，造成株高生長緩慢，葉面積以及光合參數降低[4]。鹽脅迫會抑制植物進行光合作用，一方面是無機鹽離子毒害的作用抑制了光合色素的活性；另一方面是過多的無機鹽離子影響植物細胞滲透勢從而影響光合速率。植物在逆境脅迫下凈光合速率呈下降趨勢，有機物合成減少，導致植物無法正常生長[5]。褪黑素作為抗氧化劑，既能在植物體內自身合成，也能通過施加外源褪黑素達到增強逆境脅迫抑制的目的[6]。杜天浩[7]研究表明，在鹽脅迫下，施加外源褪黑素能顯著增加番茄幼苗葉綠素的含量。根施外源褪黑素的方式能明顯減緩鹽脅迫對葡萄幼苗的損傷，并利于葡萄葉片進行光合作用[8]。研究表明，外源褪黑素能夠促進植物葉片光合相關基因轉錄水平的表達，達到保護葉片光合系統的目的[5]。褪黑素在參與植物葉片進行光合作用中發揮積極影響，通過對植物葉片光合結構以及PSII合成相關蛋白的表達提高光合作用效率。【本研究切入點】有關外源褪黑素能緩解棉花在逆境脅迫下抑制作用的報道相對較少，其中陳莉等[9]發現通過外源褪黑素浸種處理后，20 μmol/L褪黑素處理能提高棉花種子發芽率，增強棉花種子耐鹽性。袁志剛[10]研究表明，將100 μmol/L褪黑素進行灌根處理后，降低NaCl脅迫下棉花葉片中的Na+含量，抑制葉綠素含量的增長。通過噴施外源褪黑素抵御棉花幼苗在NaCl脅迫下，有關光合系統如何響應的研究尚未報道。研究外源褪黑素對鹽脅迫下棉花幼苗生長及光合特性的影響。【擬解決的關鍵問題】采用葉面噴施外源褪黑素的方法，研究在NaCl脅迫下棉花幼苗生長指標、光合參數等生理指標，分析外源褪黑素對棉花耐鹽能力的影響，以及外源褪黑素能夠緩解棉花幼苗在鹽脅迫下的生理機制，為研究棉花耐鹽栽培措施提供有利依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試棉花品種為新陸中70號。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

試驗在中國農業科學院棉花研究所溫室進行。挑選顆粒飽滿的棉籽，用0.1% HgCl2消毒處理后清洗4～5次。種于蛭石培養缽，間隔1 d澆等量蒸餾水。待子葉展平，挑選生長一致幼苗移入含有550 mL 1/4 Hoagland 營養液的水培盒中。7 d后轉為等量1/2 Hoagland水培盒中。待第4片真葉展平時進行NaCl處理，并葉面噴施外源褪黑素。測定NaCl脅迫下不同時間段(1、3、6和9 d)棉花幼苗生長指標、葉綠素含量及熒光、光合參數等指標。

葉面噴施設置4個不同褪黑素(MT)濃度處理及2個對照處理，分別是：

CK1：0 μmol/L MT+0 mmol/L NaCl；

CK2：0 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T1：25 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T2：50 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T3：100 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T4：200 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 棉花苗期生長指標

噴施等量不同濃度褪黑素處理并在鹽脅迫1、3、6和9 d時取樣，測定棉花株高、莖粗、葉面積以及生物量。每個處理選取5株幼苗測定。

1.2.2.2 葉綠素含量

稱取棉花主莖葉倒三葉0.2 g，將葉片剪碎放置于20 mL玻璃試管中，加入10 mL 95%酒精并遮光浸泡48 h，在此期間多次搖晃直至葉片完全失綠，用UH5300型分光光度計(日本日立公司生產)在波長為665、649、470 nm下測定吸光度，并計算葉綠素a、葉綠素b含量和總葉綠素含量。

1.2.2.3 葉片光合作用參數

采用美國Li-Cor公司的便攜式光合系統分析儀Li-6400測定主莖葉凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等參數。使用閉路式氣路，內置光源，并采用鋼瓶控制二氧化碳濃度，設定CO2濃度為400 μmol/mol，流速為500 μmol/s，光強為1 000 μmol/(m2·s)。環境溫度控制在25℃，相對濕度控制在70%左右，每個處理選取5株幼苗測定。

1.2.2.4 葉綠素熒光動力學參數

選取棉花幼苗主莖葉倒三葉，每個處理測定5株。將幼苗葉片進行暗適應20 min后，用Handy-PEA熒光儀(英國漢莎公司生產)測定葉片暗適應初始熒光F0和最大熒光Fm，在600 μmol/(m2·s)作用光下獲取最大熒光(Fm′)和穩態熒光(Fs)，并開遠紅光獲得初始熒光(Fo′)。參照Baker等[11]方法計算Fm、Fo、Fm′、Fs 和 Fo′，獲得PSII反應中心實際光化學效率(φPSII)，非光化學淬滅系數(NPQ)，PSII有效光量子產量(Fv′/Fm′)，光化學淬滅系數(qP)。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數據，用DPS V7.05軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗生長的影響

2.1.1 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗株高、莖粗和葉面積的影響

研究表明，NaCl(CK2)脅迫會阻礙棉花幼苗生長，株高隨著NaCl脅迫時長受到顯著抑制，在NaCl脅迫1、3、6和9 d時與對照相比分別降低6.7%、14.1%、15.5%和18.0%。噴施不同濃度外源褪黑素處理后，延緩了NaCl脅迫對株高的影響，其中噴施100 μmol/L褪黑素效果較好。NaCl脅迫1和3 d時，噴施外源褪黑素處理對棉花幼苗莖粗和葉面積無顯著差異；NaCl脅迫6和9 d后，100 μmol/L褪黑素處理與CK2相比幼苗葉面積有顯著差異，分別提高了10.5%和8.1%。表1

表1 外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗生長特性變化Table 1 Effects of exogenous melatonin on growth characteristics of cotton seedlings under NaCl stress

2.1.2 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗植株干物質積累及分配的影響

研究表明，隨著NaCl脅迫時間的增加，對棉花幼苗干物質積累造成顯著影響。棉花幼苗地上部干重、總干重均呈顯著下降趨勢。噴施外源褪黑素處理后幼苗地上部干重、總干重均有不同程度的增加，其中噴施100 μmol/L褪黑素處理較好，總干重在鹽脅迫1、3、6和9 d時，與CK2相比分別提高了25.3%、23.0%、29.3%和53.0%。表1

2.2 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合參數的影響

2.2.1 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合色素含量的影響

研究表明，NaCl脅迫會顯著降低幼苗葉片Chla、Chlb和Chla+Chlb的含量，對Chla/Chlb影響不大，NaCl脅迫處理1 d時，棉花幼苗葉片Chla、Chlb和Chla+Chlb含量分別下降了24.8%、16.8%和22.3%。隨著NaCl脅迫時間的增加，葉片光合色素含量各指標呈先上升后下降的趨勢。與CK2相比，NaCl脅迫3和6 d時，噴施100 μmol/L褪黑素處理顯著提高Chla含量，分別為16.2%和11.1%。表2

表2 外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合色素含量變化Table 2 Effects of exogenous melatonin on photosynthetic pigment content in leaves of cotton seedlings under NaCl stress

2.2.2 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗葉片光合參數的影響

研究表明，隨著處理時間的增加，Pn、Gs、Tr均呈先上升后下降的趨勢，Ci無明顯變化。NaCl脅迫會導致植物凈光合速率下降。與CK1相比NaCl脅迫(CK2)顯著降低棉花幼苗葉片的Pn、Tr、Gs和Ci。噴施外源褪黑素處理后，葉片的光合氣體參數都有不同程度的增加。其中T3處理緩解效果最好，顯著提高Pn含量。與CK2相比，NaCl脅迫1、3、6和9 d時，100 μmol/L褪黑素處理下，Pn分別提高了73.4%、49.6%、42.9%和26.4%，Gs分別提高了28.6%、14.3%、31.3%和30.0%，Tr分別提高了17.3%、23.4%、37.7%和19.1%。圖1

注：(Pn)凈光合速率、(Gs)氣孔導度、(Ci)胞間CO2濃度、(Tr)蒸騰速率。同列中不同字母表示在P<0.05水平差異顯著

2.3 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響

研究表明，PSII反應中心實際光化學效率、PSII有效光量子產量、光化學淬滅系數和非光化學猝滅系數這4項熒光指標在NaCl脅迫下均具有顯著差異。噴施外源褪黑素處理第1 d～第9 d中，φPSII隨著NaCl處理時間變化，基本保持在0.4～0.6。NaCl脅迫處理第1 d～第9 d中，φPSII呈先上升后下降，均低于CK1處理。噴施外源褪黑素處理提高NaCl脅迫下葉片φPSII，第9 d時φPSII值最低。Fv′/Fm′同φPSII變化趨于一致。NaCl脅迫下qP低于CK1處理，噴施外源褪黑素處理后，qP趨于平緩上升趨勢。NaCl脅迫提高NPQ，噴施外源褪黑素處理NPQ下降。圖2

2.4 相關性分析

研究表明，在處理6 d時，除了Chla/Chlb指標之外，其他指標與總干重達到極顯著相關性，與凈光合速率和蒸騰速率相關性較高，達到極顯著或顯著水平。通過Chla+Chlb含量的變化來影響光合系統Ⅰ和Ⅱ。表3

3 討 論

3.1 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗生長的影響

NaCl脅迫嚴重阻礙棉花幼苗生長，通過噴施外源褪黑素的方法能有利于減輕NaCl脅迫對棉花幼苗抑制作用，張娜等[12]研究表明，褪黑素處理能提高狼尾草種子的萌發能力，減輕了鹽脅迫對狼尾草幼苗生長的影響。鹽脅迫下，外源褪黑素能有效增加大豆生物量的積累，緩解大豆株高受到抑制作用，保持幼苗葉片相對含水率的穩定性[13]。試驗結果表明，棉花幼苗的株高、葉面積、干物質積累指標與CK2相比有顯著性差異。噴施100 μmol/L褪黑素處理，能有效促進棉花幼苗株高生長及生物量增加，噴施外源褪黑素能增強NaCl脅迫下棉花幼苗耐鹽性，減少對棉花幼苗的傷害。

注：(φPSII)PSII反應中心實際光化學效率、(Fv'/Fm')PSII有效光量子產量、(qP)光化學淬滅系數、(NPQ)非光化學猝滅系數。同列中不同字母表示在P<0.05水平差異顯著

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著

3.2 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗光合指標的影響

植物遇到逆境時，植物葉片光合作用會受到影響，NaCl脅迫下，棉花幼苗光合色素以及光合指標顯著降低。鹽脅迫能夠通過氣孔性限制和非氣孔性限制來調節植物的光合作用；同時也會影響植物葉綠素的合成，過多的NaCl會導致已經合成的葉綠素分解，造成葉綠素含量下降[14]。噴施外源褪黑素后，各指標均有不同程度的增加。高立楊等[15]研究表明，噴施外源褪黑素可降低鹽堿復合脅迫下垂絲海棠葉片相對含水量、葉綠素相對含量和 Pn、Gs、Tr指標的幅度，并具有明顯的濃度效應。外施褪黑素能有效降低鹽脅迫下番茄幼苗PSII，減緩葉綠素含量及Pn降低，增強番茄幼苗的耐鹽能力[16]。試驗中，NaCl脅迫下，Pn呈下降趨勢，可能是因為NaCl脅迫影響了棉花幼苗根系的活力，導致葉片氣孔部分關閉，Ci也出現下降趨勢。氣孔限制也是棉花幼苗葉片凈光合速率下降的原因。當噴施100 μmol/L褪黑素處理后，Pn、Gs、Ci和葉綠素含量都有所增加，可能是因為褪黑素對PSII潛在的活性有促進作用。褪黑素能有效調節NaCl脅迫下棉花幼苗葉片的光合作用，提高NaCl脅迫下棉花幼苗葉綠素的含量，對棉花幼苗耐鹽性有促進作用。

3.3 噴施外源褪黑素對NaCl脅迫下棉花幼苗熒光指標的影響

棉花幼苗葉片PSII活性會受到NaCl脅迫的約束，葉片φPSII、Fv′/Fm′以及qP呈下降趨勢。φPSII表示PSII反應中心實際光化學效率，由于碳固定下光合電子合成減少從而導致φPSII下降，進一步說明了NaCl脅迫能夠通過非氣孔因素表達對植物光合系統的響應。qP表示PSII原初電子受體QA的氧化還原狀態，qP值越大，說明PSII電子傳遞的活性較高。

qP下降說明了PSII受到損傷后，阻礙了光合電子的傳遞，有效反應光下降。Fv′/Fm′下降是因為光捕捉后沒有迅速進行光合電子傳遞，直接通過葉綠素的轉化消耗光能，同時導致PSII下降。NPQ是非光化學淬滅指標，反映了葉綠素吸收及轉化的過程。干旱脅迫下，外源褪黑素有效增強玉米幼苗葉綠素含量，降低NPQ，防止光合系統受損[17]。研究表明[18]在高鹽脅迫環境下，PSII反應中心實際光化學效率也會受到顯著制約，其功能受到損害。在試驗中，NaCl脅迫造成NPQ上升，同時也是造成PSII、Pn下降的原因。通過葉面噴施100 μmol/L褪黑素，φPSII、Fv′/Fm′以及qP都有不同程度提高，NPQ下降，說明了褪黑素能有效提高棉花葉片PSII光化學效率和光合速率。

4 結 論

4.1葉面噴施外源褪黑素能延緩NaCl脅迫對棉花幼苗的損傷，有利于幼苗株高、莖粗以及葉面積的生長。噴施褪黑素處理，能有效調控棉花幼苗在NaCl脅迫下生物量的變化。噴施外源褪黑素在NaCl脅迫下幼苗葉片Chlb、Chla/Chlb上無明顯表現，僅顯著表現在Chla上。外源褪黑素處理能顯著提高棉花幼苗NaCl脅迫下光合作用的能力。NaCl脅迫顯著降低幼苗葉片φPSII和Fv′/Fm′，噴施外源褪黑素能有效緩解Fv′/Fm′持續下降的趨勢。

4.2NaCl脅迫下噴施100 μmol/L褪黑素能促進棉花幼苗生長發育，顯著提高棉花幼苗葉片光合色素含量，有效提高棉花葉片PSII光化學效率和光合速率，增強棉花幼苗耐鹽能力。