狗牙根地下芽休眠進程中生理物質的變化規(guī)律

王雪如，閆 鋒，張海燕，馬金燕，張延輝

(新疆農業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院/西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室/新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】狗牙根(CynodondactylonL.)是一種典型的具有休眠特征的多年生草本，在草坪綠地中應用廣泛，屬于C4途徑的植物，抗旱性很強，但當秋季降臨，其上部莖葉即慢慢枯黃，進入休眠，是狗牙根生存的策略之一[1-2]，狗牙根是一種暖季型草坪草，在入秋后緩慢進入枯黃，即進入休眠狀態(tài)，由地下根莖及芽維持生命，芽內的生理物質在響應休眠的過程中發(fā)揮重要作用，研究狗牙根休眠過程中生理物質的變化規(guī)律，了解狗牙根資源的生長習性，對于如何更好的在草坪綠地建設中發(fā)揮作用具有重要意義。【前人研究進展】多年生草本植物，營養(yǎng)繁殖是其繁衍的主要方式之一，地下部分尤其是根部的休眠芽對于植株的再生有非常重要的作用。羊草地下芽庫中各類型芽及所形成子株和母株的季節(jié)動態(tài)變化研究結果表明，當年返青母株是由上1年母株形成的80%的分蘗芽與分蘗芽子株，15%的根莖頂芽與根莖頂芽子株，以及5%根莖節(jié)芽和根莖節(jié)芽子株組成的，分蘗芽與分蘗芽子株是返青母株的主體[3]。分蘗特性是草坪綠地質量的關鍵。休眠是次年分蘗誘發(fā)的主要影響因素，分蘗芽通常都經歷過休眠過程。植物進入休眠期后，各項生理物質都會發(fā)生變化。蓋樹鵬等[4]研究牡丹芽休眠的生理機制，發(fā)現活性氧、自由基在低溫處理初期迅速上升、保護酶系初期保持較低的活性，有利于保持較高膜脂過氧化水平，增加膜脂透性，促進休眠解除；休眠基本解除時，活性氧迅速下降。膜脂過氧化可能作為休眠解除的信號物質在早期起作用。劉國琴等[5]研究中華壽桃花芽在2013～2015年2年度間休眠進程，發(fā)現花芽內休眠及其解除過程中花芽可溶性蛋白質含量逐漸降低，而總氨基酸含量則逐漸升高，POD活性和H2O2含量呈相似的變化趨勢；抗壞血酸(AsA)含量呈現“升-降-升-降”的變化規(guī)律。Somayeh Esmaili等[6]研究發(fā)現，狗牙根降低溫度和光照時間會增加脯氨酸含量；在芽和根中，還原糖隨溫度降低而增加，而隨光持續(xù)時間降低而下降。Matthew J. Fagerness等[7]研究發(fā)現，當溫度較低時，導致狗牙根草坪密度和質量下降，低溫降低了狗牙根的競爭力，而低溫是誘發(fā)狗牙根休眠的主要原因。【本研究切入點】針對植物休眠的研究，大多數都集中在木本植物芽的休眠或者種子的休眠，在草本植物中對根莖上芽的休眠研究很少，對于狗牙根芽休眠的機理研究幾乎未見報道。作為一種復雜的生命活動過程，芽休眠受多個因素的綜合調控[8]，研究滲透調節(jié)物質、膜質氧化、幾種關鍵酶的變化等解析狗牙根芽休眠的生理變化動態(tài)。【擬解決的關鍵問題】采集8種不同地區(qū)狗牙根的地下芽，對狗牙根芽體進行滲透調節(jié)、膜質氧化、酶活性等生理指標的測定。研究狗牙根地下芽休眠的生理響應規(guī)律，分析狗牙根休眠時生理物質響應規(guī)律，為研究狗牙根休眠機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗區(qū)位于新疆農業(yè)大學三坪實習基地內，該區(qū)域87°40′24″E、43°46′12″N，海拔約739 m。晝夜溫差大，寒暑變化劇烈，降水偏少，四季分配不均，冬季長，夏季短，春秋不明顯，常出現大風和驟然降溫天氣。全年平均氣溫7.2℃，1月平均氣溫-17℃，7月平均氣24.6℃，極端最高氣溫42℃，極端最低氣溫-38℃。年均降水量228.8 mm，年均蒸發(fā)量2 647 mm。試驗地土壤類型為沙性壤土，無鹽堿危害，土壤土層較厚，土壤理化性狀和土壤質地良好。

在2019年度采集新疆農業(yè)大學草坪草資源圃內的8種狗牙根材料(品種)，將其營養(yǎng)體(根莖)種植于花盆內，在新疆農業(yè)大學網室栽培養(yǎng)護。表1

表1 8種狗牙根材料采集地點Table 1 Collection sites of eight Cynodon dactylon (L.) Pers.

1.2 方 法

狗牙根夏季生長旺盛，在9月下旬緩慢進入休眠狀態(tài)，地上部分葉片逐漸變黃。在2019年8月6日(未休眠)、9月16日(休眠起始)和10月16日(休眠中)3個不同時間段，分別采集8份狗牙根種質材料的地下芽，每份種質材料取30個。采集的芽用錫箔紙包好迅速放入液氮罐中，帶回實驗室后取出放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采集的狗牙根芽體進行常規(guī)生理指標的測定，游離脯氨酸含量采用茚三酮法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，SOD、POD活力、MDA含量，均參照李合生的方法[9]。

1.3 數據處理

芽體使用軟件LASV4.6采集圖像并作對比。試驗結果采用Excel 2010、SigmaPlot 12.5和SPSS 21等軟件進行數據整理、統計分析。

2 結果與分析

2.1 游離脯氨酸含量

研究表明，在休眠前期-休眠起始-休眠進入3個階段(8月、9月、10月)，狗牙根地下芽體內的脯氨酸含量隨著溫度下降，總體呈上升趨勢，變化范圍為296.157～839.1 364 μg/gFW。在未休眠階段(8月)，脯氨酸整體含量與9、10月相比都比較低，其中，C45含量最低(35.069 6 μg/gFW)，C130含量最高為499.447 μg/gFW，其次是C48為430.061 μg/gFW。在休眠起始階段(9月)，除個別材料外(新農1號、托克遜)，其余狗牙根芽中脯氨酸含量均有增加，C130含量最高為1 058.79 μg/gFW。在休眠中的階段(10月)，狗牙根芽中脯氨酸含量達到最大值，其中，C45脯氨酸含量值為752.515 μg/gFW，C130達到最大值為1 072.84 μg/gFW。圖1

圖1 不同休眠時期狗牙根芽內脯氨酸含量比較Fig.1 Comparison of proline content in budof Cynodon dactylon (L.) Pers.during different dormancy period

2.2 可溶性蛋白含量

研究表明，8月可溶性蛋白含量很低，C66含量最低為0.000 1 mg/g，C48含量最高為0.002 mg/g，與9、10月相比，差異顯著(P<0.05)。9月可溶性蛋白含量增加，C66含量為0.567 mg/g，C48含量增加到1.595 mg/g，C133可溶性含量為2.021 mg/g，表明在休眠起始，可溶性蛋白開始顯著增加。進入休眠中(10月)，可溶性蛋白繼續(xù)增加，C66和C130含量較高，分別為4.338和4.367 mg/g，C48含量也有增加，值為1.787 mg/g，但增加幅度顯著低于其他地區(qū)狗牙根。C133持續(xù)增加到3.644 2 mg/g。圖2

圖2 不同時間段可溶性蛋白含量比較Fig.2 Comparison of soluble protein content in different time interval

2.3 保護酶系統

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性

研究表明，狗牙根芽體內SOD活性隨時間變化先升高后降低。8月新農3號芽內的SOD活性最低為86.469 μ/gfW，顯著低于其他地區(qū)狗牙根(P<0.05)，C133芽內酶活性高于其他地區(qū)狗牙根芽，活性值為174.781 μ/gfW。9月狗牙根芽內的活性均升高，新農3號芽內酶活性增加至170.883 μ/gfW，C133增加到204.515 8 μ/gfW，其中C66SOD活性最低為168.375 μ/gfW，C45SOD活性最高為237.48 μ/gfW，顯著高于其他地區(qū)狗牙根(P<0.05)。到10月狗牙根芽內的活性明顯下降，C133SOD活性最低為31.177 μ/gfW，略低于其他品種，新農3號芽內酶活性降低到32.020 4 μ/gfW，C48SOD活性均高于其他品種為89.232 μ/gfW。狗牙根芽體SOD活性有所上升，SOD活性減少，狗牙根已進入休眠期，直到細胞膜失去活性，莖葉死亡。圖3

2.3.2 過氧化物酶(POD)活性

比較狗牙根芽內3個不同生長時期內POD活性值，其變化趨勢與SOD相似，先升高后降低，但降低后的活性值大體上高于8月的活性。8月C39的POD活性顯著低于其他地區(qū)狗牙根為908.854 U-1min-1(P<0.05)，C45的POD活性最強為2 407.75 U-1min-1。9月POD活性值升高，其中C48的POD活性較低為1 243.56 U-1min-1，C39芽內酶活性增加到2 355.5 U-1min-1，C45芽內POD活性增加到2 545.71 U-1min-1，新農1號的POD活性顯著高于其他地區(qū)狗牙根值為3 608.58 U-1min-1。到10月呈下降趨勢，新農1號POD活性值降為1 321.5 U-1min-1，C45降到1 608.469 5 U-1min-1，C39降低到1 854.99 U-1min-1。圖4

圖3 不同時間段SOD活性比較Fig.3 Comparison of SOD activities in different time interval

2.4 丙二醛(MDA)含量

研究表明，在8、9月，新農1號MDA含量最低為0.004 μmol/g，C133的MDA含量值顯著高于其他狗牙根為0.010 μmol/g(P<0.05)，其次是C66，其活性值為0.008 μmol/g。9月這些地區(qū)狗牙根(C45、C48、C66、新農1號、新農3號)芽內MDA含量上升，膜質抗氧化能力偏弱。在未進入休眠之前，各種狗牙根芽體內的MDA含量基本保持穩(wěn)定，屬于較高的水平，不同材料在2個月之間呈現出差異，但差異不顯著(P<0.05)。

10月后，狗牙根芽內的MDA含量值均降低，顯著低于8和9月的含量值，新農1號芽內MDA含量降低至0.001 μmol/g，C133芽內MDA含量降到0.003 μmol/g。其中C48最低為0.001 μmol/g。圖5

圖4 不同時間段POD活性比較Fig. 4 Comparison of POD activities in different time interval

圖5 不同時間段MDA含量的比較Fig. 5 Comparison of MDA content in different time interval

3 討 論

目前，已有大量的研究發(fā)現，植物芽休眠進程與脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物質的變化密切相關[10-13]。但這些生理物質的變化規(guī)律卻不盡一致，不同物質響應的規(guī)律有差異。

植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，把脯氨酸含量變化作為抗脅迫的重要生理指標。在植物休眠的進程中，發(fā)現低溫往往是與休眠相伴，在狗牙根中低溫是誘導休眠的關鍵因素。在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)植物體內脯氨酸的含量顯著增加[14,15]。鄭小林等[16]研究結果認為，假儉草經過低溫處理后，葉片的游離脯氨酸隨溫度的降低而大量累積。王洪春[17]研究認為，草坪草在低溫下游離脯氨酸的大量積累是對低溫脅迫的一種適應性反應。黃錦文等[18]發(fā)現在低溫脅迫下，溝葉結縷草和結縷草體內脯氨酸含量都極顯著遞增；陳登文等[10]發(fā)現，在杏枝芽休眠期間，脯氨酸隨著低溫需求量的增加，會出現增加趨勢，脯氨酸含量與低溫需求量存在著相關關系。試驗與該研究相一致，10月緩慢進入低溫階段，狗牙根芽中脯氨酸含量達到最大值，由于低溫影響，狗牙根準備進入休眠階段，脯氨酸的積累可以幫助機體度過低溫逆境。

植物進入休眠后，芽體內水分含量及存在狀態(tài)、膜透性、可溶性蛋白、碳水化合物、脯氨酸等含量均發(fā)生顯著變化。于芹[13]研究油桃芽體隨自然休眠誘導進程的發(fā)展，發(fā)現9月底10月初，休眠誘導后期芽體總含水量逐漸下降并穩(wěn)定在較低的水平，芽體開始進入自然休眠期。芽體MDA含量均呈下降趨勢，花芽中降幅較大。芽體可溶性蛋白和脯氨酸含量隨著休眠誘導進程的發(fā)展呈上升趨勢。研究結果也顯示，隨著溫度降低，狗牙根進入休眠，芽體內的可溶性蛋白也隨之升高，低溫環(huán)境對狗牙根造成一定的傷害，因此，體內可溶性蛋白大量積累以減少低溫對機體的傷害，持續(xù)降溫，狗牙根會進入休眠狀態(tài)以度過低溫階段。

多項研究表明，POD、SOD等是植物體內的保護酶系統，它們之間相互協調，共同協作，清除膜脂過氧化過程中產生的活性氧[19,20]。多項研究表明，SOD、POD活性與休眠進程相關，敏感響應期約在進入休眠誘導期的前1周[12]。暖季型草坪草在受到低溫脅迫時，體內保護酶系統會提高酶活性，幫助機體度過逆境，長期的低溫影響會使狗牙根進入休眠狀態(tài)，其酶活性也會隨之降低。研究中也發(fā)現，SOD在狗牙根進入休眠后保持較低水平，與未休眠前相比較，明顯降低，而且該指標在不同狗牙根材料中的表現比較一致。而對于POD酶，休眠前后也有波動，在休眠中比較穩(wěn)定。

MDA含量是植物細胞膜質過氧化程度的體現，一般植物在逆境條件下就會產生膜質過氧化。畢磊研究梨花芽休眠特性及解除休眠，表明MDA含量自然休眠期間下降。范克欣[11]研究表明，油桃休眠期間花芽內MDA含量在休眠初期持續(xù)上升，在深休眠期降低并一直保持較低水平。進入休眠后，膜質過氧化程度加重，MDA含量降低。研究中，狗牙根芽在休眠階段MDA含量顯著降低，該指標對于發(fā)現狗牙根進入休眠的進程具有指示作用，可以作為狗牙根芽進入休眠的判定指標。

4 結 論

狗牙根芽體內的脯氨酸大體上隨休眠進程的深入而升高，到10月，由于低溫影響，狗牙根已經完全進入休眠階段，脯氨酸的積累可以幫助機體度過低溫逆境。狗牙根在休眠階段中，芽體內可溶性蛋白大量積累。狗牙根芽體SOD活性有所上升，其原因可能是自身為了防御低溫，狗牙根即將進入休眠時做出的應對反應。SOD活性減少，狗牙根已進入休眠期，直到細胞膜失去活性，莖葉死亡。C130的POD活性值相對于其他地區(qū)狗牙根芽內酶活性較高為2 059.26 U-1min-1不同的材料之間，芽體的膜質抗氧化能力不同，芽體內的細胞大多發(fā)生了膜脂過氧化，膜的通透性進一步降低，生理生化反應幾乎停滯，狗牙根已經進入休眠。

狗牙根芽休眠進程與脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物質的變化密切相關，狗牙根芽隨著溫度的降低，逐漸進入休眠，脯氨酸、可溶性蛋白含量在大量積累，SOD、MDA含量下降，保持較低水平，可將游離脯氨酸和可溶性蛋白大量升高作為參考指標判定休眠的起始。