基于生物信息學分析的激素性股骨頭壞死相關核心基因和通路識別

王 寬，茆 軍，張 立，邢潤麟，梅 偉，丁 亮，張農山，王培民

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫院骨科，江蘇 南京 210029）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是指高劑量激素導致股骨頭活性成分死亡的病理過程。SONFH 是非侵襲性壞死最常見的原因之一[1]，在沒有有效治療的情況下，80%的患者會在1～3 年內出現股骨頭塌陷，且難以逆轉[2]，大多數患者需要人工關節置換術。SONFH 主要發病人群為中青年，但人工關節置換術的長期效果仍難以預測[3]。因此，SONFH 早期階段的檢測、尋找有效的方法就顯得尤為重要。然而現有的SONFH 生物標志物預測價值有限，迫切需要進一步深入研究SONFH 發生發展的分子機制，從而實現SONFH的早發現、早診斷、早治療，以提高治療效果，改善患者預后。基因芯片是基于堿基互補配對原則，利用化學的合成等技術，出現的高通量測序方法[4]。研究顯示[5]，疾病的發生是受特異基因表達量的變化影響，這些基因變化的表達水平與人類正常的表達水平有明顯的不同。本研究基于生物信息學提取差異基因，研究其所在通路及參與的生理病理過程，從而發現關鍵性的致病基因，旨在為SONFH的早期發現和診斷提供方向，預測潛在的SONFH 治療藥物，為SONFH的分子發生機制、臨床診斷和藥物治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 芯片數據的篩選 截止至2020 年11 月，以“steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，homo sapiens”為關鍵詞從公共基因表達總表（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）搜索目標基因芯片，經過篩選，最終選取GSE123568 作為本次研究的目標數據基因芯片。GSE123568 共有40 個樣本，由30例SONFH 患者樣本和10例健康樣本組成。

1.2 SONFH 差異表達基因篩選 GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）是一個基于R 語言的差異表達基因（DGEs）篩選工具，比較之間的差異。得到差異分析結果。在此結果中篩選差異表達基因，需同時滿足以下2 個條件：①adj.P＜0.01；②|log2FC|＞5，即差異倍數（Foldchange）FC＞32 或FC＜-32。

1.3 PPI 網絡的構建及核心基因的篩選 將潛在靶點導入STRING 數據庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）獲取蛋白互作網絡（PPI），使用CytoscapeV3.7.0可視化，并完成拓撲分析。運用cytoHubba 插件，獲取排名前10 位的核心基因。

1.4 SONFH 差異表達基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）將篩選出的差異表達基因上傳至Metascape 數據庫（https://metascape.org/），進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO分析包括生物學過程、細胞成分、分子功能3 方面內容，主要對差異表達基因進行生物學過程、細胞成分、分子生物學功能進行分析;KEEG 主要針對差異表達基因的信號通路進行富集分析。

1.5 核心基因生物進程可視化與GSEA 分析 核心基因的選擇以不低于10 度進行。Cytoscape的生物網絡基因腫瘤學工具（Bingo）插件幫助可視化了核心基因的生物分析過程。同時應用MSigDB v7.0 進行GSEA 分析。

1.6 SONFH 潛在治療藥物篩選 藥物-基因相互作用數據庫（DGIdb，https://dgidb.org/）是一個整合了來自組織和展示論文、數據庫和網絡資源的藥物-基因相互作用和基因可藥性信息的數據庫。將核心基因列表上傳到DGIdb 數據庫，根據得分篩選潛在治療藥物。

2 結果

2.1 SONFH 差異表達基因篩選結果 按照篩選條件，得到GSE123568 共有的160 個差異表達基因，其中上調基因34 個，下調基因126 個，見圖1。

圖1 差異基因火山圖

2.2 SONFH 差異表達基因富集分析 GO 功能富集分析主要分為BP、CC 和MF，見圖2。BP 主要包括紅細胞發育、輔因子代謝過程、含卟啉化合物的生物合成過程、陽離子穩態等生物學過程。CC 主要有光譜蛋白相關細胞骨架、基底外側質膜、線粒體基質、真空裂解等細胞成分。MF 主要集中于細胞骨架的結構組成、2 鐵-2 硫簇合、驅動蛋白結合、蛋白質同源二聚活性等分子功能。KEGG 通路分析結果見圖3，有助于找出針對差異基因的最明顯豐富的途徑。特異性信號轉導途徑主要表現為脂肪酸延長、癌癥中的轉錄失調、醛固酮調節的鈉重吸收、卟啉與葉綠素代謝等。

圖2 GO 富集分析

圖3 KEGG 富集分析

2.3 SONFH 差異表達基因的PPI 網絡構建和核心基因篩選結果 將差異基因提交至String 平臺，得到PPI 網絡，經過Cytoscape的cytoHubba 插件篩選得到12 個核心基因見表1，PPI 網絡見圖4。

圖4 差異基因PPI 圖

表1 核心基因

2.4 生物進程可視化與GSEA 分析 核心差異基因的分析共有10 個基因，并且度值不低于10。分析其潛在價值的生物學分析過程見圖5，可見紅細胞發育在細胞生物學過程中的重要性。GSEA 結果表明，核心差異基因的異常調節與一些重要的生物學過程有關，包括JAK-STAT 通路、toll 受體通路、溶酶體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性，見圖6。

圖5 核心基因的生物分析過程

圖6 GSEA 基因集濃縮圖譜

2.5 SONFH 潛在治療藥物預測篩選結果 根據PPI網絡中篩選出的10 個核心基因，分別為SLC4A1、EPB42、ALAS2、AHSP、GYPB、EPB41、KLF1、RHAG、FECH、SPTA1。在DGIdb 數據庫中尋找相關潛在藥物，最后搜索發現共4 個基因具有相關藥物。由基因SLC4A1 預測到的潛在治療藥物有美托洛爾、阿替洛爾；由ALAS2 預測到的潛在治療藥物有甘氨酸、磷酸吡哆醛；由AHSP 預測到的潛在治療藥物有富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵甘氨酸；排名前3的藥物甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵作為候選治療藥物。

3 討論

本研究通過對GEO 數據庫中的SONFH 進行生物信息學分析獲得差異表達基因，并分析了有關這些基因富集的生物學過程、細胞成分、分子功能和信號通路，為SONFH的機制研究提供了理論依據與研究方向參考。分析可見，SLC4A1、EPB42、ALAS2、AHSP、EPB41、KLF1 等核心差異基因多為紅細胞發育相關膜蛋白，其異常表達常常會引起紅細胞周期停滯、溶血性貧血等可能[6]。異常形態紅細胞可使血液黏滯性增加，血流緩慢，加之變形性差，易堵塞毛細血管引起局部缺氧和炎癥反應。股骨頭的微循環作為循環系統的終末分支，關節軟骨下負重側微血管的分布均較非負重側密集股骨頭相對較差，局部的微循環阻塞，繼而引起骨內壓增加，導致股骨頭缺血性壞死[7]。

在骨壞死的發病機制中，類固醇對凝血功能的影響可能發揮著關鍵作用。既往研究表明[8]，類固醇還會影響內皮細胞功能，干預血管修復和新血管生成，導致凝血酶和其他血管活性物質的產生，影響血漿纖溶酶原激活物抑制和組織纖溶酶原激活之間的平衡。最后結局就是血栓形成。另外，類固醇同時干預脂質的代謝和動態平衡[9]，兩者都會加劇高凝狀態，減少流向股骨頭等敏感部位的血流。此外臨床研究表明[10]，低肝CYP3A 活性和幾種基因多態性與類固醇誘導的ONFH的風險顯著相關。核心差異基因的異常表達人群，可能具有更強的遺傳易感性。對于類固醇對機體影響，耐受性更差，導致了SONFH的高發生率。

GSEA 分析結果可見多通路在SONFH 發病機制中扮演角色。JAK-STAT 通路少數多效級聯反應之一，與體內發育和體內穩態的多種信號相關。介導細胞因子和生長因子的主要信號傳導。可能在SONFH的發生發展中起著中介作用。Toll 受體通路可通過誘導促炎性細胞因子的產生和共刺激分子的上調來激發先天免疫的快速激活，主要激活NFκB 和MAPK 產生促炎細胞因子。研究表明[11]，類固醇通過作用于NF-κB（RANK）和RANK-配體的受體激活（RANK-L）來刺激骨丟失，而RANK-L 是激活破骨細胞和輔助T細胞免疫的關鍵系統。溶媒體是動物細胞中膜定界的細胞器，是細胞的主要消化腔室，進行各種大分子的降解，是細胞自噬的最終結局。實驗研究表明[12]，自噬參與了SONFH的病理過程，并與細胞凋亡密切相關，自噬與骨細胞的相互作用與激素的劑量有關，還影響SONFH 中成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用。自然殺傷細胞介導的細胞毒性作為先天免疫系統，其所含的效應蛋白穿透細胞膜并誘導程序性細胞死亡。

避免手術、藥物控制是多數SONFH 患者的期待治療，尋找有效、敏感的治療SONFH 藥物有助于改善患者的預后。本研究預測了甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵3 種藥物。甘氨酸為內源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，在神經信號的傳遞以及參與各種生理和病理反應中起著的重要基礎作用，發揮著抗炎、免疫調節和細胞保護作用[13]。在缺血再灌注損傷中，因缺血而破壞的組織細胞，再灌注又加重這種破壞。巨噬細胞和中性粒細胞的激活、氧自由基和毒性因子的生成、降解酶如蛋白酶的活化導致炎癥反應、組織破壞和功能衰竭。甘氨酸可以通過上述機制抑制這些反應,保護細胞免受缺血再灌注損傷，也可以通過保護線粒體功能，促進缺血部位的血管再生以延緩股骨頭壞死的進展[14]。富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵主要是治療缺鐵性貧血的藥物，補充鐵劑，促進血紅蛋白的形成[15]。與SONFH 相關的研究，目前暫缺。有待醫學的進一步發展。

綜上所述，目前的研究首次確定了SONFH 患者的10 個核心基因。在其發生和進展過程中起著重要作用。此外，JAK-STAT 通路、Toll 受體通路、溶媒體、自然殺傷細胞介導的細胞毒性在其中扮演主要角色。預測了甘氨酸、富馬酸亞鐵、硫酸甘氨酸亞鐵作為治療SONFH的潛在藥物。進一步闡明SONFH的發病機制和生物學進程，有待于臨床試驗和基礎研究的開展。