活血解毒中藥配伍對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬損傷的保護(hù)機(jī)制

譚 令，付長庚，2，鄧 秘，曲 華，2，于子凱，2，黃明艷，龍霖梓

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100091)

近年研究表明，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)，尤其是缺血性心臟病已發(fā)展為中國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的疾病類型[1]，及時、有效的血液再灌注治療對于維持心臟功能和減少心肌損傷有重要作用。但在一定情況下，隨著血液灌流的恢復(fù)，心肌組織功能不僅不能恢復(fù)，反而造成更嚴(yán)重的心肌結(jié)構(gòu)損傷和心肌功能障礙，這一病理過程稱為心肌的缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)。因此，探索MIRI的病理生理機(jī)制，并采取針對性的治療策略是臨床上亟需解決的難點(diǎn)之一。

自噬是一種進(jìn)化保守的真核細(xì)胞內(nèi)特有的溶酶體依賴性的胞內(nèi)物質(zhì)的分解代謝過程。在關(guān)于MIRI病理機(jī)制的探索過程中，已有研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬貫穿MIRI發(fā)生發(fā)展的全過程，甚至可誘發(fā)心肌細(xì)胞的凋亡及壞死，而PI3K/Akt/mTORC1 通路是對自噬起負(fù)調(diào)控作用的主要信號通路。自噬在MIRI不同時期發(fā)揮的作用是不同的，該通路主要通過調(diào)節(jié)mTOR的活性調(diào)控自噬活性：在心肌缺血階段，心肌組織因血液供應(yīng)不足及ATP生成減少，致心肌mTOR的表達(dá)受到抑制，ULK1復(fù)合體被激活后轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬泡膜形成，啟動自噬[2]。研究表明[3]，自噬對于維持心肌缺血損傷時的細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因?yàn)榇穗A段自噬水平輕度增強(qiáng)，自噬體可通過消化破損的線粒體等細(xì)胞器， 避免受損的線粒體釋放凋亡因子，保護(hù)心肌細(xì)胞免于死亡；而在再灌注階段，由于血液的重新供應(yīng)，大量活性氧產(chǎn)生及Ca2+超載等原因引起B(yǎng)eclin-1 激活，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬過度增強(qiáng)，加重心肌細(xì)胞的損傷，甚至出現(xiàn)細(xì)胞壞死，但此期心肌組織的血供被恢復(fù)后，血液中的生長因子、細(xì)胞因子和激素等成分可激活PI3K/Akt 信號通路，進(jìn)而使其下游mTOR的抑制作用被解除，mTOR 激活后抑制再灌注期過度自噬的發(fā)生，從而保護(hù)心肌的缺血/再灌注損傷。

MIRI 據(jù)其臨床癥狀可歸屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“真心痛”等范疇，《素問·脈要精微論》曰：“夫脈者，血之府也，長則氣治，短則氣病，……澀則心痛”，說明血脈瘀滯可致胸痹心痛，瘀血阻滯血脈，致氣、水、血運(yùn)行不暢，繼而引起氣滯、痰飲、瘀血等實(shí)邪內(nèi)停，久則蘊(yùn)結(jié)為濁毒之邪，毒邪與瘀血、痰濁膠結(jié)，纏綿難解， 日久必郁而化火，邪熱易耗氣傷血，而心主血脈，故毒瘀最易損傷心臟而發(fā)胸痹、心痛之癥。臨證針對此類病機(jī)所致之胸痹，最當(dāng)行活血解毒藥之法。

活血解毒中藥配伍由川芎、赤芍和黃連三藥組成，是課題組長期應(yīng)用于臨床并獲得顯著效果的經(jīng)驗(yàn)方，既往藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，活血解毒中藥組分川芎嗪[4]、赤芍總苷[5]、黃連素[6]等均能有效改善MIRI，且不良反應(yīng)較少，但尚未有研究證實(shí)上述活血、解毒中藥配伍應(yīng)用對MIRI的治療機(jī)制，因此，本實(shí)驗(yàn)決定在前期研究的基礎(chǔ)上，以缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞模擬心肌缺血/再灌注損傷的體外模型，進(jìn)一步探究活血解毒中藥對MIRI 的治療作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 H9C2細(xì)胞購自中橋新舟。

1.1.2藥物 活血解毒中藥由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3主要試劑與儀器 氯喹(targetmol，T0194)、CCK8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Beyotime， C0037)、LC3(CST，12741)、β-catenin(affinity，AF6266)、Beclin-1(abcam， ab62557)、Bcl-2(abcam，ab196495)、磷酸酶抑制劑(碧云天，S1873)、PMSF(碧云天，ST506)、RIPA 裂解液(碧云天，P0013B)、BC 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，P0010)、蛋白marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司，DM111)、顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)。

酶標(biāo)儀(Thermo，MULTISKAN MK3)、垂直電泳槽(北京六一儀器廠， DYCZ-24DN)、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40)、離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，HI650)、電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-7C)。

1.2 方法

1.2.1缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型的建立與分組 取對數(shù)生長期H9C2心肌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。以DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和 100 kg·L-1鏈霉素)制成細(xì)胞懸液，以5×107個·L-1細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。藥物處理24 h后，將心肌細(xì)胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基21%氧濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h，制造H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。實(shí)驗(yàn)共分為7組，正常對照組：H9C2心肌細(xì)胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)；模型組：按上述方法制備缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型；活血解毒中藥組：在缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入適宜濃度的活血解毒中藥提取物；PI3K抑制劑LY294002組：在缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入PI3K抑制劑LY294002；溶酶體抑制劑氯喹組：在缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入溶酶體抑制劑氯喹； 活血解毒中藥聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組：在缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入活血解毒中藥和LY294002；活血解毒中藥聯(lián)合溶酶體抑制劑氯喹組：在缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入活血解毒中藥和氯喹。

1.2.2藥物配置 將川芎提取物：赤芍提取物：黃連提取物按1 ∶1 ∶1 配比，用PBS配制成一定濃度的母液，超聲溶解，高壓滅菌后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3藥物適宜濃度的篩選 取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，以合適的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，藥物處理24 h，將心肌細(xì)胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基21%氧濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h，CCK8檢測細(xì)胞活性。

1.2.4細(xì)胞活性的檢測 取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，以5×107個·L-1細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。藥物處理24 h后，將心肌細(xì)胞置于1% O2、94% N2和5% CO2的低氧飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基21%氧濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h。每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD450。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測 取處于對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到5×108個·L-1，接入6孔板，每孔1 mL細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)過夜；按分組處理后，收集細(xì)胞，按試劑盒說明依次加入Annexin V-FITC和PI室溫避光反應(yīng)10 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.6激光共聚焦顯微鏡觀察 取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，以合適的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時，將GFP標(biāo)記的LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中。培養(yǎng)24 h后按照分組處理，DAPI核染。將處理后的各組細(xì)胞于共聚焦顯微鏡下拍攝細(xì)胞自噬流。

1.2.7實(shí)時熒光定量 PCR 檢測 取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，TRIzol 法提取總RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40循環(huán)。引物序列：LC3 Forward(CTTCTGAGCCAGCAGTAGGG LC3 Reverse(GAGGGACAACCCTAACACGA)、Beclin-1 Forward(AGGTTGAGAAAGGCGAGACA)、 Beclin-1 Reverse(AATTGTGAGGACACCCAAGC)、 Bcl-2 Forward(GAGGATTGTGGCCTTCTTTG)、Bcl-2 Reverse(ACAGTTCCACAAAGGCATCC)、 β-actin Forward(CTCCATCCTGGCCTCGCTGT)、 β-actin Reverse(GCTGTCACCTTCACCGTTCC)。

1.2.8Western blot檢測 細(xì)胞培養(yǎng)同“1.2.1”。加入裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，繼而低溫離心后取上清分裝。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將蛋白變性完后冷卻至室溫。然后依次進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和一抗、二抗孵育。二抗孵育結(jié)束后，TBST洗滌3次，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液在成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 給藥濃度的確定如Fig 1，中藥提取混合物的IC50為5.067 g·L-1；濃度低于0.05 g·L-1時對細(xì)胞增殖的影響不明顯，而高于0.15 g·L-1時又會對細(xì)胞造成損傷。因此，0.15 g·L-1濃度的中藥提取液既有利于心肌細(xì)胞的增殖，又能很大程度地緩解缺氧/復(fù)氧帶來的自噬損傷，所以選擇此藥物濃度進(jìn)行后續(xù)的自噬機(jī)制研究。

Fig 1 Screening of mixed Chinese medicine extract concentration

2.2 各組細(xì)胞生長活性的比較如Fig 2，H9C2 細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞生長活性降低。與缺氧/復(fù)氧處理組相比，經(jīng)活血解毒中藥和溶酶體抑制劑氯喹預(yù)處理后，細(xì)胞生長活性增加；經(jīng)PI3K抑制劑LY294002處理后，細(xì)胞生長活性進(jìn)一步降低；活血解毒中藥和LY294002聯(lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞生長活性高于單獨(dú)LY294002處理，但低于單獨(dú)活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉?lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞生長活性高于單獨(dú)活血解毒中藥處理或單獨(dú)氯喹處理。結(jié)果提示，缺氧/復(fù)氧能降低細(xì)胞生長活性，且與PI3K通路密切相關(guān)。

Fig 2 Detection of cell growth activity

2.3 活血解毒中藥對缺氧/復(fù)氧 H9C2心肌細(xì)胞凋亡率的影響如Fig 3，H9C2細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞凋亡率增加。與缺氧/復(fù)氧處理組相比，經(jīng)活血解毒中藥和氯喹預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率顯著降低；經(jīng)LY294002預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加；活血解毒中藥和LY294002聯(lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率低于單獨(dú)LY294002處理，但高于單獨(dú)活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉?lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率低于單獨(dú)活血解毒中藥處理或單獨(dú)氯喹處理。

Fig 3 Detection of apoptotic rate

2.4 活血解毒中藥對缺氧/復(fù)氧 H9C2心肌細(xì)胞自噬水平的影響如Fig 4，H9C2細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞綠色點(diǎn)狀聚集物明顯增多，自噬水平增加。與缺氧/復(fù)氧處理組相比，經(jīng)活血解毒中藥和氯喹預(yù)處理后，細(xì)胞綠色點(diǎn)狀聚集物明顯減少，自噬水平降低；經(jīng)LY294002預(yù)處理后，細(xì)胞綠色點(diǎn)狀聚集物進(jìn)一步增多，自噬水平進(jìn)一步增加；活血解毒中藥和LY294002聯(lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞綠色點(diǎn)狀聚集物少于單獨(dú)LY294002處理，但多于單獨(dú)活血解毒中藥處理?；钛舛局兴幒吐揉?lián)合預(yù)處理后，細(xì)胞綠色點(diǎn)狀聚集物少于單獨(dú)活血解毒中藥處理或單獨(dú)氯喹處理。

Fig 4 Autophagy protein LC3 observed by fluorescence microscopy, with a scale of 25 μm

2.5 活血解毒中藥對缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)Beclin-1、LC3和Bcl-2 mRNA水平的影響如Fig 5，H9C2細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，Beclin-1和LC3 mRNA 表達(dá)顯著增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低，說明缺氧/復(fù)氧能夠引起自噬水平增加，且能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與缺氧/復(fù)氧處理組相比，經(jīng)過活血解毒中藥和氯喹預(yù)處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)顯著降低，而Bcl-2 mRNA 表達(dá)升高；經(jīng)LY294002預(yù)處理后，Beclin-1和LC3 mRNA 表達(dá)升高，而Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯降低；經(jīng)活血解毒中藥和LY294002聯(lián)合預(yù)處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)水平較LY294002單獨(dú)處理降低，但較單獨(dú)活血解毒中藥處理升高，而Bcl-2 mRNA表達(dá)較LY294002單獨(dú)處理明顯升高，較單獨(dú)活血解毒中藥處理明顯降低；經(jīng)活血解毒中藥和氯喹聯(lián)合預(yù)處理后，Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)氯喹或活血解毒中藥處理均降低，而Bcl-2 mRNA表達(dá)較單獨(dú)氯喹或活血解毒中藥處理均升高。

Fig 5 mRNA expression in cells

2.6 活血解毒中藥對缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 6，H9C2細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加，p62、p-AKT、p-mTOR表達(dá)降低，PI3K/Akt/mTORC1通路活化減弱，自噬增強(qiáng)；凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，凋亡增加。與缺氧/復(fù)氧處理組相比，經(jīng)過活血解毒中藥和氯喹預(yù)處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)減少，p62、p-AKT、p-mTOR表達(dá)增加，PI3K/Akt/mTORC1 通路活化增強(qiáng)，Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達(dá)降低；經(jīng)過LY294002預(yù)處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加，p62、p-AKT、p-mTOR和Bcl-2表達(dá)降低；Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65表達(dá)增加；活血解毒中藥和LY294002聯(lián)合預(yù)處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65等蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)LY294002處理升高，但其較單獨(dú)活血解毒中藥處理降低，p62、p-AKT、p-mTOR 的表達(dá)則相反；活血解毒中藥和氯喹聯(lián)合預(yù)處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin、p-p65 等蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)氯喹或活血解毒中藥處理升高，p62、p-AKT、p-mTOR 的表達(dá)水平則較單獨(dú)氯喹或活血解毒中藥處理降低。

Fig 6 Protein expression in cells

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)是一系列心血管疾病發(fā)生的重要病因[7]。目前，對于缺血性心臟病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術(shù)等雖可顯著改善患者心肌缺血的癥狀和預(yù)后，但由于MIRI的存在，心肌缺血經(jīng)治療后一年內(nèi)仍有較高的心力衰竭發(fā)生率[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)H9C2心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下，細(xì)胞生長活性降低，凋亡率增加，在激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)顯著增加，表明體外MIRI 模型建立成功。且本研究與屈玉春等[9]研究結(jié)果一致，表明缺血處理可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡，同時激活自噬，而再灌注處理使得自噬被過度激活， 則加速心肌細(xì)胞死亡。

心肌缺血期，心肌細(xì)胞由于缺乏能量供應(yīng)而發(fā)生大量壞死和凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵起始基因，caspase-3 通過自身的寡聚化活化為凋亡的主要執(zhí)行者Cleaved caspase-3，其通過激活下游多種蛋白酶而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。因此，caspase-3的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡開始執(zhí)行且不可逆轉(zhuǎn)[10]。p65是構(gòu)成核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 異源二聚體的亞基之一，當(dāng)p65被磷酸化激活后，可通過上調(diào)下游靶基因的表達(dá)，啟動細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。此外，在心肌缺血期，因能量危機(jī)致心肌細(xì)胞大量凋亡的同時，還伴有自噬的輕度激活。此期自噬的發(fā)生可消化受損的線粒體，并產(chǎn)生新的能量和原料，使缺血損傷的心肌獲得修復(fù)，且能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，顯著降低心肌細(xì)胞的凋亡率[12]。因此，MIRI的心肌缺血期主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡和自噬激活介導(dǎo)對心肌的保護(hù)。

再灌注時期，心肌細(xì)胞由于恢復(fù)了能量供應(yīng)，產(chǎn)生大量氧自由基產(chǎn)生，引起自噬的異常過度激活。有研究表明，在再灌注過程中，自噬加速可引起心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]。Beclin-1與Bcl-2是調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白，且Bcl-2是自噬和凋亡的中央調(diào)控因子[14]。此兩者的平衡狀態(tài)是調(diào)控自噬與凋亡相互反饋?zhàn)饔玫年P(guān)鍵因素，在再灌注過程中，Beclin-1的表達(dá)量明顯增多，致Bcl-2與Beclin-1表達(dá)失衡，則Bcl-2表達(dá)的相對下調(diào)既可誘發(fā)凋亡加重，又可通過激動Beclin-1來激活自噬，加速心肌細(xì)胞死亡[15]。因此，MIRI 的再灌注期主要表現(xiàn)為心肌自噬的過度激活及其引起的細(xì)胞凋亡加重。

參與再灌注過程中的自噬相關(guān)蛋白還包括 LC3 和 p62 等。其中 LC3 主要介導(dǎo)自噬體的成熟：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例越高說明自噬活性越強(qiáng)，因此 LC3 可用于相對定量地評價自噬體的活性程度[16]。p62則參與自噬的降解，通過與LC3蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并將LC3與待降解泛素化生成物連接，最終于溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解，因此，p62可隨著自噬作用的進(jìn)行而不斷被消耗[17]。

本研究采用了氯喹干預(yù)作為對照組，因氯喹具有溶酶體趨向性，能選擇性地進(jìn)入溶酶體內(nèi)，破壞溶酶體的酸性環(huán)境，使溶酶體不能降解自噬體包裹的受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等物質(zhì)，從而抑制細(xì)胞自噬過程。研究結(jié)果顯示氯喹干預(yù)組的自噬和凋亡水平較模型組降低，同時，聯(lián)合運(yùn)用活血解毒中藥與氯喹干預(yù)也導(dǎo)致心肌細(xì)胞的自噬和凋亡水平較單獨(dú)運(yùn)用活血解毒中藥組或單獨(dú)運(yùn)用氯喹組更低，說明活血解毒中藥能有效抑制心肌細(xì)胞的自噬和凋亡。且研究檢測發(fā)現(xiàn)，H9C2細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、β-catenin 和p-p65等介導(dǎo)自噬或凋亡的蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2、p62、p-AKT和p-mTOR等抑制自噬或凋亡的蛋白表達(dá)降低，活血解毒中藥預(yù)處理可有效逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)，再次證明活血解毒中藥能抑制MIRI過程中自噬和凋亡的發(fā)生。

為進(jìn)一步明確活血解毒中藥抑制缺氧/復(fù)氧心肌自噬和凋亡的分子信號通路機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了PI3K特異性抑制劑LY294002干預(yù)組作為對照組[18]，從而使PI3K/Akt/mTORC1通路被抑制。研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用LY294002處理缺氧/復(fù)氧的H9C2細(xì)胞可導(dǎo)致其自噬和凋亡水平升高，而聯(lián)合運(yùn)用活血解毒中藥與LY294002 預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的自噬和凋亡水平較單獨(dú)LY294002處理降低，但較單獨(dú)活血解毒中藥處理升高，說明活血解毒中藥可能是通過調(diào)控PI3K信號通路降低心肌細(xì)胞的自噬和凋亡水平，從而有效保護(hù)心肌細(xì)胞的缺血/再灌注損傷。

綜上所述，活血解毒中藥配伍可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTORC1自噬通路，降低心肌細(xì)胞自噬和凋亡水平，從而對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究證實(shí)了活血解毒中藥可有效保護(hù)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷，為臨床合理治療心肌缺血/再灌注損傷開辟了思路。