基于網絡藥理學和分子對接技術探討功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風的作用機制

張田義，賴新星，李婷婷，解小龍，劉偉地，楊芩瑜，李 影，高 穎

(北京中醫藥大學 1. 東直門醫院、2. 中醫腦病研究院，北京 101121)

缺血性卒中(ischemic stroke，IS)是指因腦部血液循環障礙，發生缺血、缺氧所導致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化而出現相應的神經系統功能缺損。在世界范圍內，中風是致死、致殘的首要原因。缺血性腦卒中約占卒中總人數的80%。然而，目前治療缺血性卒中的最有效手段是溶栓或機械取栓，但由于受眾面小，且時間窗狹窄，故僅有少數的人從這些有限的有效干預中受益[1]，挖掘和開發對缺血性卒中的有效治療方式具有重要的臨床和公共衛生價值。

缺血性卒中屬于傳統醫學“中風”范疇，傳統治法包括益氣活血法、化痰祛瘀法等，近年來隨著研究治法的深入，發展了清熱化瘀、溫陽通絡等治法。在中醫治療中風病長期歷史實踐中，包括董老在內的眾多中醫名家皆有經驗方傳承，且臨床效果甚佳，但因為中醫藥復方多成分、多靶點作用的特點，尚未闡明作用機制。本文通過網絡藥理學及分子對接技術，初步探索董老經驗藥對功勞葉、仙鶴草(Gonglaoye and Xianhecao herbal pair，GLY-XHC)治療中風的作用機制，為進一步的實驗證據和臨床推廣提供思路。鑒于功勞葉和枸骨葉在歷史上存在名稱混淆現象，從現代研究看枸骨葉提取成分與傳統北方處方的功勞葉作用相符，故本文通過檢索枸骨葉獲取功勞葉藥物成分[2]。

1 材料與方法

1.1 GLY-XHC化學成分的收集通過TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫，分別以“枸骨葉”“仙鶴草”為關鍵詞檢索功勞葉、仙鶴草中的化合物成分。以藥物動力學原理為基礎，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，篩選出符合條件的成分作為活性成分。

1.2 GLY-XHC靶點篩選及“藥物-化合物-靶點”網絡構建查閱文獻及檢索TCMSP數據庫，篩選功勞葉、仙鶴草活性成分及其相對應的靶點，借助Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)對靶點的基因名稱進行校正。將靶點蛋白導入Cytoscape3.7.1軟件構筑“藥物-化合物-靶點”網絡并進行分析。

1.3 GLY-XHC治療缺血性中風的潛在作用靶點預測分別在DrugBank(https://go.drugbank.com)，GeneCards(https://www.genecards.org)，DisGeNET(https://www.disgenet.org)，Therapeutic Target Database(http://db.idrblab.net/ttd)和OMIM(https://omim.org)中以“ischemic stroke”為關鍵詞進行檢索，獲取疾病相關基因，將其與“1.2”項下篩選得到的復方靶點相互映射，獲得治療IS疾病的潛在靶點。

1.4 蛋白互作網絡構建與分析將“1.3”項下篩選得出GLY-XHC可能具有治療IS作用的潛在作用靶點輸入STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)，規定種屬為“Homo Sapiens”，得到蛋白互作關系并將數據保存為TSV格式文件。將所得文件導入到Cytoscape3.7.1軟件中構建蛋白互作網絡并分析條件篩選核心靶點。

1.5 靶點富集分析為深入了解上述篩選出的GLY-XHC治療IS的潛在作用靶點基因的功能以及在信號通路中的作用，運用DAVID 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進行GO及KEGG 通路富集分析，設置P<0.05，將物種定義為“Homo Sapiens”。按照其富集的靶點數目進行排序，選取KEGG通路前20個條目進行可視化。

1.6 分子對接為了進一步驗證本研究的可靠性，從蛋白互作網絡中獲得核心靶點，進行分子對接。我們使用Autodock Vina分析每種蛋白質配體的結合特性[4]，為了準確評估預測目標，蛋白結構在對接之前需要對蛋白結構進行預處理，因為蛋白結構解析的時候會存在結構缺失，原子的局部電性沒有標出，沒有明確水分子的位置，以及氫原子的位置信息。首先從RCSB Protein Data Bank(http://www.pdb.org)下載PPI 網絡中前5的核心靶點蛋白結構，為了保證分子對接的可靠性，我們選擇分辨率小于3.0 a的蛋白質晶體結構來建立分子對接模型。可以通過PyMOL篩選制備對接配體，包括水缺失和原始配體的提取。然后通過Autodock工具以PDBQT格式保存蛋白質和配體[3]。最后通過Dock計算，將預測的藥效團特征與前5個目標化合物分子擬合。當Docking Score絕對值>4.25表示分子與靶點具有一定的結合能力，>5.0表示結合能力較強，>7.0表示結合能力很強[4]。

2 結果

2.1 GLY-XHC中活性成分的篩選通過 TCMSP數據庫得到GLY-XHC中化合物共97個，其中56個來自功勞葉，41個來自仙鶴草，根據OB≥30%同時DL≥0.18的標準，篩選得出GLY-XHC的活性化合物去重后共11個，再根據文獻中報告了藥對中含量較高，藥理活性較強，雖然不滿足OB及DL，也補充進藥物主要成分，如熊果酸(ursolic acid)、綠原酸(3,4-di-o-caffeoylquinic acid)、金絲桃苷(Hyperin)等[5]。匯總后藥物化合物成分共17個，見Tab 1。

2.2 “藥物-化合物-靶點”網絡分析分析網絡中包含464個節點(其中藥物節點2個，活性化合物節點去重后17個，以及445個靶點節點)及1 874條邊。網絡中黃色橢圓代表功勞葉和仙鶴草，紅色三角形代表復方活性化合物，靶基因用紫色橢圓表示。在網絡中，每條邊表示節點與節點之間的互作關系。度值表示節點與其他節點的連接數目，運用“Network analyze”插件進行分析。篩選度值(degree)較為顯著的節點，所得節點在網絡中可能起到關鍵作用。活性化合物與靶點之間的多重對應關系體現了中藥復方的復雜性，同時各成分與靶點之間相互作用可能是中藥復方發揮整體性治療的體現。基于以上理論，根據度值(degree)排名前5位的分別為槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、熊果酸、金絲桃苷、木犀草素，可與202、202、202、202、101個靶基因相互作用，其中前4位為藥對共有的化合物，度值較高，可能在藥對中起關鍵作用，是藥對的核心化合物。在靶點中，根據degree排名前 5位的靶點，分別是CYP19A1、ALOX5、ESR2、TERT、MMP2，分別能與 18、16、16、15、14 個活性化合物相互作用。

2.3 GLY-XHC治療缺血性中風核心靶點預測及篩選運用DrugBank、GeneCards、DisGeNET，TTD和OMIM數據庫共篩選得到3 238個IS的潛在靶點，運用Venny 2. 1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制GLY-XHC活性成分靶點和IS靶點的韋恩圖，并得到交集靶點共296個，即為預測GLY-XHC治療IS的潛在靶點。

2.4 GLY-XHC治療缺血性中風的核心靶點預測及分析將“2.3”項下篩選得到的296個潛在靶點輸入STRING 11.0數據庫中，得到蛋白互作網絡。借助Cytoscape 3.7.1軟件構建PPI網絡，其中共包含296個節點，4 212條邊。同樣應用Network analyse插件進行分析，得出靶點度值(degree)，根據度值降序排序，排名前5的靶點為AKT1、MAPK3、IL6、ALB、TNF，分別能與86、86、83、77、73個靶點相互作用，可能是GLY-XHC藥對的核心靶點。

2.5 富集分析通過DAVID數據庫分析得到2 500個GO富集條目(P<0.05)，其中包括126類細胞組分(cell composition，CC)、161種細胞功能(molecular function，MF)和2 213個生物過程(biological processes，BP)。BP方面主要涉及對氧化合物的反應、對有機物質的反應、細胞對化學刺激的反應、對有機氮化合物的反應、細胞代謝的正調控、恒定作用、積極調節刺激反應、細胞通訊等過程。MF方面，離子結合、有機環化合物結合、信號傳導器活性、信號受體活性等富集較為顯著，見Fig 1。

Fig 1 GO enrichment of GLY-XHC targets

通過 DAVID 數據庫共篩選得到 KEGG 通路119條(P<0.05)，主要涉及神經活性受體配體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、cAMP信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路等。排名前20的通路利用氣泡圖進行可視化(Fig 2)。縱軸表示通路的名稱，橫軸表示富集值，氣泡的大小表示富集在該通路上的基因數目。

Fig 2 KEGG enrichment of proteins in core PPI network

2.6 分子對接在分子對接前，將核心靶點AKT1，MAPK3，IL6，ALB，TNF的蛋白結構從PDB數據庫下載。分子對接結果顯示GLY-XHC的核心化合物和潛在作用靶點的對接得分均≤-5.0 kcal·mol-1，由此可以表明GLY-XHC與預測的作用靶點有較強的結合活性。具體分子對接分數見Tab 2。配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大[3]。Fig 3-5以三維模式表示了各核心受體的活性位點中與小分子配體的結合模式，細節圖顯示小分子配體與受體H原子發生氫鍵作用，相應的殘基通過標簽標出，因此通過驗證我們認為熊果酸、金絲桃苷等是GLY-XHC中重要的潛在活性化合物。

Tab 2 Five potential target protein interacting with five key molecules

Fig 3 Receptor reacting with ligands

3 討論

缺血性中風發病原因、病理過程及相關機制復雜多樣，除靜脈溶栓和機械取栓外只能以內科保守治療為主，缺乏有證據的有效治療措施，中藥具有多成分多靶點的作用特點，可針對缺血性卒中發病的各個時點，不受時間窗局限，因此基于名家經驗探討中藥治療中風的機制具有重大意義。

傳統醫學認為中風是陰陽失調、氣血逆亂，上犯于腦所引起的以突然昏仆，不省人事，半身不遂，口舌歪斜，為主要表現的一種病證，其理論源流從《內經》薄厥、風痱到《金匱要略》內虛邪中，發展到明清時期的肝陽化風，氣血并逆，直沖犯腦所致。隨著生活節奏的加快和工作壓力的提升，中風的發病群體逐漸向中年人、青年人群偏移，其“內風正虛”應有別于傳統的年老氣血本虛。其病機一方面由于壓力過大，煩勞過度使陽氣升張，另一方面兼有生活節奏加快、休息不足造成的氣血耗傷，從而陰陽失調，氣血逆亂，發為中風。古云：“氣有余便是火，氣不足便是寒”，但是針對上述的中風好發證型，兼有氣不足、虛火上浮，陽氣升張的情況，若大量黃芪、人參補氣虛，會發生舌躁目赤、胸腸滿悶等狀況。這就是補氣藥不適量導致的虛火上浮、虛不受補。若用少量參芪，療效又不顯著，因個體差異大，故最適劑量難以掌握。若以仙鶴草、功勞葉搭配補氣則可虛火不生，彌補參芪補氣之不足。

Fig 4 Receptor reacting with ligands

Fig 5 Receptor reacting with ligands

功勞葉、仙鶴草是中醫內科學奠基人董建華教授的臨證經驗藥對，在董老的學術傳承過程中，被應用在脾胃病、老年病、中醫急癥等各個方面，且取得了良好的臨床療效。仙鶴草始載于《滇南本草》，苦涼之品，入肺、肝、脾，具有收斂止血、解毒補虛的功效，因其藥性平和，兼有補虛固脫的作用。《百草鏡》言其可“下氣活血，理百病”。古今醫家取其收斂止血之功治療吐血、瘧疾寒熱等癥，但對其補氣功效則多忽略。江浙一帶農村稱本品為“脫力草”，有補虛強壯之功，可用治勞力過度所致的脫力勞傷，癥見神疲乏力、面色萎黃者，常配紅棗煮食，調補氣血、治脫力勞傷，效果很好。現代藥理研究表明，仙鶴草提取物在抗炎、抗氧化領域具有確切的藥理作用，抗炎機制除了絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)/p38信號通路外，還可能涉及到iNOS和COX2蛋白表達水平的下調，以及MAPK/JNK的失活[6]。仙鶴草能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-1等促炎因子的表達，通過調節TRIF依賴的Syk-PLCγ/AKT信號通路發揮抗炎作用。仙鶴草內酯和去甲基仙鶴草內酯通過清除自由基的活性，激活Nrf2通路，抑制p38磷酸化，激活ERK、JNK、MAPK蛋白磷酸化，提高SOD抗氧化酶活性，有效地減輕了H2O2誘導的細胞損傷。功勞葉又稱枸骨葉，性涼味苦，入肝腎，清熱養陰，益腎平肝，用于肺癆咯血，骨蒸潮熱，頭暈目眩。《本經逢源》中記載功勞葉與紅棗熬蜜膏可治勞傷失血萎蒻。現代藥理研究表明，枸骨葉具有降血脂、抗心肌缺血、抗氧化、抗菌、免疫抑制等作用，將仙鶴草與功勞葉配伍，用于氣虛患者，絕無虛火上浮之弊。有虛火者亦能清退。

為了進一步研究與探討功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風的藥效基礎及潛在的生物學機制，本文利用網絡藥理學平臺技術，通過篩選功勞葉、仙鶴草17個化合物，篩選藥效靶點，獲得296個疾病與藥物交集靶點，構建蛋白互作網絡，基因靶點富集分析及通路預測等手段，得到5個相關重要成分，分別是槲皮素、山萘酚、熊果酸、金絲桃苷、木犀草素。其中槲皮素、山奈酚、熊果酸、金絲桃苷可與202個靶點蛋白發生作用，可見其是GLY-XHC治療缺血性中風關鍵成分。槲皮素具有神經保護、抗氧化、抗炎的作用，廣泛應用于腦及脊髓損傷的動物模型中，有研究表明槲皮素可以通過保護神經元及線粒體功能來減輕腦卒中后帶來的繼發性損害[7]。槲皮素神經保護功能已得到廣泛應用，但槲皮素的藥理機制研究仍在深入，其臨床使用價值還在不斷進行探索。而山奈酚具有抗氧化活性，調節巨噬細胞，保護細胞損傷。近年來研究標明熊果酸具有多種神經保護作用，已經在缺血性腦血管病中顯示出治療前景，主要通過激活Nrf2-ARE通路，減少脂質過氧化物的堆積，保護大腦免受局灶性腦缺血后的氧化損傷；抑制MAPK信號通路的激活，減輕腦缺血/再灌注損傷；抑制Ca2+內流改善缺血區血流狀況。金絲桃苷也被報告了對腦缺血、缺氧具有保護作用，主要通過抑制NO釋放、Ca2+超載減少神經細胞缺氧損傷。

根據功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風的蛋白互作網絡結果分析得出296個靶點，通過分析發現AKT1、MAPK3、IL6、ALB、TNF等靶點可能是治療缺血性中風的關鍵靶點。其中AKT是一種激酶，在調節細胞增殖、生長和存活過程中發揮重要作用，Akt包含3種結構相似的同型異構體，分別為Akt1，Akt2和Akt3。Akt1在控制細胞增殖、存活和凋亡中發揮至關重要作用，能被多種上游細胞因子(如血管內皮生長因子等)激活，進而對缺血性損傷后的神經元發揮保護作用。Akt1基因缺失會誘導血管內皮細胞功能障礙，細胞血管平滑肌遷移和存活改變，促進動脈粥樣硬化[8]。MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶，又稱JNK)，屬于MAPK和JNK家族成員，激活的JNK信號通路對細胞分化、凋亡、應激反應、炎癥反應、缺血再灌注損傷等生理病理過程起著至關重要的調節作用[9]。白細胞介素-6(interleukin6，IL-6)是一種集多種生物學效應如機體防御、免疫反應和造血反應等于一身的細胞因子，缺血半暗帶中神經元損傷程度與IL-6表達水平高度相關[10]。人血白蛋白(ALB)也被證明在缺血/再灌注的治療中有作用，有研究表明，大劑量ALB可顯著減少大鼠模型缺血再灌注導致的腦梗死體積以及減輕腦水腫[11]。腫瘤壞死因子(TNF)屬于發生缺血早期產生的炎性因子，可激活白細胞黏附到腦缺血區微血管內皮細胞上，引起內皮細胞皺縮、破裂和壞死，破壞血腦屏障，并可在細胞因子作用下進入缺血區導致嚴重的炎癥反應，從而加重腦組織損傷，也有研究表明TNF與IS后梗死體積相關[12]。本文篩選得到的核心靶點和文獻報道的腦缺血重要靶標基本一致。

通過GLY-XHC治療缺血性中風的靶點GO富集分析得出，對氧化合物的反應、對有機物質的反應、細胞對化學刺激的反應、對有機氮化合物的反應、細胞代謝的正調控、恒定作用、積極調節刺激反應、細胞通訊等過程。KEGG富集通路分析得出，功勞葉、仙鶴草藥對治療缺血性中風的潛在靶點主要涉及神經活性受體配體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路等。鈣信號通路是導致神經元缺氧損傷的重要因素，腦缺血能導致胞膜及胞內鈣通道激活，改變了神經元中的Ca2+信號傳導，進而影響它們對缺血的反應，誘導細胞內鈣離子水平升高，是缺血后神經細胞內復雜信號通路激活的重要介質[13]。Rap1信號通路在血小板整合素激活及血小板生成過程中發揮重要作用[14]。其中，PI3K-Akt信號通路通過分析發現其應用廣泛，與多條調節通路有關。在腦中風早期，神經細胞以壞死為主，其后以凋亡為主，在大鼠局灶性腦缺血模型中發現了嚴重的神經凋亡現象，PI3K-Akt 信號通路與腦缺血發生后細胞的凋亡有密切關系，多種神經營養因子、缺血后處理及中藥通過激活 PI3K/Akt信號通路抑制細胞凋亡來實現神經的營養及保護作用[15]。由此可見，GLY-XHC藥對主要通過PI3K-AKt通路以及與腦缺血相關的多個通路影響腦缺血后的病理變化。

分子對接結果顯示，功勞葉、仙鶴草藥對的核心有效化合物槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、熊果酸和木犀草素(luteolin)與核心靶蛋白AKT1、IL-6、ALB、TNF、MAPK3的結合能均遠小于-5 kJ·mol-1，由此可見這些核心化合物與受體蛋白的結合活性較高，進一步驗證了網絡藥理學所得出的結果。

綜上所述，本文基于董老經驗藥對，通過網絡藥理學方法對功勞葉、仙鶴草用于缺血性中風治療的作用機制進行了分析討論，在初步篩選出的作用靶點基礎上再結合分子對接分析進行驗證。結果顯示，GLY-XHC藥對中金絲桃苷和熊果酸等成分可能通過PI3K/AKT等信號通路，作用于AKT1、IL-6、ALB、TNF、MAPK3等靶點，發揮神經保護、減輕再灌注損傷、抑制細胞凋亡、抗炎等作用。并從中醫整體觀出發，揭示中藥多成分、多靶點的協同治療作用，對后期進一步確定關鍵活性成分、新藥研發具有一定的指導意義。但本研究仍有一定的局限性，由于數據庫的數據及相關文獻有限，基于本文所預測得出功勞葉-仙鶴草治療靶點所展示的相關通路，后續將重點開展GLY-XHC治療腦缺血的相關實驗實證工作，以期為IS治療藥物的研發提供方向及依據。