AMPK抑制劑增加阿司匹林對肝癌的抑制作用

孫昊璐，吳一萬，卞和格，金 娟

(安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，安徽 合肥 230032)

阿司匹林是一種被廣泛使用的非甾體抗炎藥，已有100多年的歷史。研究發現，阿司匹林可以預防多種癌癥，其中包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。此外，阿司匹林還可以降低癌癥發病率和死亡率[1-2]。大量的證據證實阿司匹林對多種癌癥均有預防作用[3]。然而，HCC細胞對阿司匹林的應答可能會導致阿司匹林抵抗性的產生，目前針對此領域仍然缺乏足夠的認識。

自噬是細胞通過雙膜細胞器自食的過程，自噬參與了應激條件下的細胞穩態，包括能量限制、營養缺乏、缺氧和細胞應激[4]。越來越多的證據表明，自噬在HCC疾病中具有關鍵作用[5]。既往有研究表明自噬具有抑制腫瘤生長的功能。與此同時，另一些研究人員認為，HCC細胞依賴自噬生存。盡管自噬與細胞類型和環境應激有關，其作用是抗癌還是促癌仍存在爭議[6-7]。

阿司匹林通過抑制環氧化酶(COX)、前列腺素和其他炎癥介質的產生，從根本上抑制癌癥[8]。有研究表明，除了COX，阿司匹林還可能靶向其他蛋白，如腺苷單磷酸活化蛋白激酶((adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)，在代謝應激中調節能量穩態和代謝應激，從而促進細胞生存[9-10]。AMPK信號被認為是阿司匹林誘導細胞產生自噬的關鍵因素[11]。AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與了自噬的起始階段。在營養缺乏的情況下，激活的AMPK通過抑制mTORC1，觸發自噬起始[7, 12]。部分研究表明，阿司匹林可能是通過誘導自噬抑制腫瘤血管生成的作用[13-14]。相反，也有研究發現AMPK介導的mTORC2和髓細胞白血病-1(myeloid leukemia-1，MCL-1)的上調可能會損害阿司匹林的抗癌作用[9]。這些發現提示，自噬可以激活并參與阿司匹林對HCC疾病的治療作用。然而，阿司匹林誘導的自噬作用是促進肝癌細胞存活還是抑制肝癌細胞生長仍存在較大的爭議。本研究旨在探討阿司匹林治療HCC的可能機制，以及評估阿司匹林單獨或聯合AMPK抑制劑治療肝癌的療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑肝癌細胞株HepG2購買于中國科學院(上海)細胞株庫。阿司匹林(貨號：A2093)、Compound C(貨號：866405-64-3)、CCK-8(貨號：96992)以及二乙基亞硝胺(DEN) (貨號：NO756-10ML)均購自美國Sigma。使用的抗體為:抗AMPK(貨號：ab3759)、抗mTOR(貨號：ab2732)、抗Beclin-1(貨號：ab62557)、抗LC-3(貨號：ab62721)、抗TFEB(貨號：ab270604)均購自美國Abcam。

1.2 細胞培養HepG2細胞保存于含有10%胎牛血清(FBS)、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1硫酸鏈霉素的DMEM中，在37℃、5%CO2、95%空氣濕度的培養箱中進行培養。

1.3 二乙基亞硝胺(DEN)誘導的大鼠肝癌模型成年雄性SD大鼠，6周齡，購自安徽醫科大學動物中心。大鼠飼養于安徽醫科大學基礎醫學院動物房，室溫(28±2)℃，濕度45%-60%。整個實驗過程中，所有大鼠常規飼養。模型組大鼠于8周齡時，進行腹腔DEN注射。DEN注射條件為：50 mg·kg-1DEN，每周1次，連續注射18周。DEN注射12周后開始進行阿司匹林治療，將大鼠隨機分為4組，每組5只，腹腔灌注生理鹽水(對照組)、DEN組(模型組)、阿司匹林5、50 mg·kg-1。所有的動物都可以自由獲得水和飼料。所有實驗經安徽醫科大學實驗動物委員會批準。

1.4 組織病理學檢查實驗結束后，按照動物倫理準則，將所有動物進行麻醉后犧牲。所有組織樣本均取自肝左葉。采用含40%福爾馬林的固定液固定組織，石蠟包埋后進行組織切片，組織切片厚度為5-6 μm，HE染色。

1.5 Western blot肝組織收集后，用RIPA裂解緩沖液肝組織進行總蛋白的提取。用Lowry蛋白法測定蛋白濃度。用抗AMPK、LC3、mTOR和β-actin的小鼠或人的抗體和相應的辣根過氧化物酶(HRP)結合的山羊抗兔抗體(1 ∶10 000)進行免疫印跡檢測分析。采用增強化學發光系統進行顯影。

1.6 平板克隆形成試驗HepG2細胞置于的6孔板中培養，培養密度為1×104個/孔。培養24 h后給予阿司匹林治療。將培養細胞分為4組：對照組、阿司匹林2.5、5、10 mmol·L-1。刺激48 h后，棄掉藥品培養液更換正常培養液，所有細胞正常培養20 d，PBS仔細清洗3遍，每孔加5 mL甲醇，固定15 min，棄去固定液，每孔加入Giemsa染色液2 mL，孵育20 min，純水洗凈，晾干，拍照。使用Image-Pro Plus軟件計算克隆的數量。

1.7 細胞凋亡檢測將細胞(5×104個/孔)接種于12孔板中培養過夜，加不同濃度的阿司匹林24 h。棄掉培養液，PBS清洗2次。每孔加入膜聯蛋白V結合液400 μL，膜聯蛋白V/FITC染色液5 μL，碘化丙啶染色10 μL。混合后置于室溫，避光反應15 min，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡率。

1.8 細胞增殖測定CCK-8法：取指數生長期的HepG2細胞，以8×104個/孔的密度種在96孔板上孵育過夜。然后，在用藥品刺激細胞之前，細胞用無血清培養基饑餓培養24 h。阿司匹林處理細胞24 h或48 h后，按照10 ∶1加入CCK-8試劑，加入細胞，37 ℃、5% CO2培養箱孵育2 h。450 nm測量OD值。細胞相對活力測定公式如下:細胞相對活力/%=(實驗樣品OD值-空白對照組OD值)/(對照OD值-空白對照組OD值)×100%。

2 結果

2.1 阿司匹林抑制DEN誘導的HCC為驗證阿司匹林對DEN誘導的肝癌的保護作用，將SD大鼠腹腔注射DEN 12周后，給予SD雄性大鼠阿司匹林5、50 mg·kg-1·d-1進行灌胃，連續8周。DEN給藥20周后，DEN組小鼠肝臟/體質量比值較正常組明顯增加。不同濃度的阿司匹林組間大鼠的肝/體質量比與正常組相比，沒有明顯差異(Fig 1A)。收集肝臟組織后分別檢測DEN組和阿司匹林治療組大鼠的病理切片(Fig 1B)。正常對照大鼠肝臟切片顯示肝臟組織學正常，肝細胞呈放射狀排列，圍繞中央靜脈。經DEN處理的大鼠肝臟切片顯示肝小葉已喪失其特征性外觀，肝細胞壞死、變形、形態異常、結締組織增生。阿司匹林治療組的大鼠肝切片顯示，肝細胞正常排列并且有一定的恢復。

2.2 阿司匹林對DEN誘導的大鼠肝癌中自噬的影響因為激活AMPK會導致自噬，所以我們設計了自噬相關實驗進行檢驗。此外， LC3-Ⅱ是自噬標記物。將AMPK和LC3蛋白與β-actin蛋白條帶強度表達相比較，分析其蛋白表達水平。如Fig 2所示，在5和50 mg·kg-1阿司匹林處理下，AMPK蛋白表達增加。與模型組比較，阿司匹林組LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白比值較高。

2.3 阿司匹林對HepG2細胞增殖的影響為了驗證阿司匹林對肝癌細胞增殖的影響，本實驗分別用不同濃度的阿司匹林處理HepG2細胞，然后進行CCK-8分析。阿司匹林以時間及劑量依賴的方式抑制HepG2細胞的增殖(Fig 3A)。為進一步驗證阿司匹林對肝癌細胞增殖的抑制作用，采用能反映癌細胞增殖和侵襲的平板克隆形成實驗[15]。結果顯示，阿司匹林明顯抑制HepG2細胞的克隆形成(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of aspirin on cell growth and clone formation of HCC cells n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2.4 阿司匹林誘導HepG2細胞自噬Western blot檢測HepG2細胞中Beclin-1蛋白的表達。結果顯示，2.5、5 mmol·L-1阿司匹林均明顯刺激HepG2細胞中Beclin-1的表達，Fig 4。轉錄因子EB(TFEB)通過驅動自噬和溶酶體基因的表達來協調這一過程。因此，我們檢測了TFEB在阿司匹林治療后的表達。本研究中，2.5和5 mmol·L-1阿司匹林促進TFEB表達增加，與Beclin-1表達結果相一致(Fig 4)。

Fig 4 Autophagy in HepG2 induced by aspirin n=3) **P<0.01 vs control group.

2.5 阿司匹林對HepG2細胞AMPK相關自噬的影響最近有研究表明，阿司匹林通過直接激活AMPK和抑制mTOR信號通路來靶向調節細胞內能量代謝和穩態[11]。因此，我們研究了AMPK和mTOR信號在阿司匹林治療的HCC細胞生長中的作用。結果顯示，阿司匹林上調HepG2細胞中AMPK，降低了mTOR的表達(Fig 5)。綜上所述，這些數據表明阿司匹林可激活AMPK信號并抑制mTOR而誘導自噬產生。

Fig 5 Effect of aspirin on AMPK and mTOR expression in HepG2 cells by Western blot n=3)

2.6 阿司匹林聯合AMPK抑制劑協同抑制HCC細胞增殖和克隆形成阿司匹林誘導HCC細胞自噬激活，此過程可能與阿司匹林抵抗有關，我們推測AMPK抑制劑Compound C可能通過抑制自噬增強阿司匹林抗HCC作用。為了確定抑制自噬是否能增強阿司匹林抗HCC作用，我們采用阿司匹林聯合Compound C進行檢驗。Compound C作為AMPK抑制劑在已發表的論文有較多使用，根據既往研究，我們選擇了兩種劑量(5、10 μmol·L-1)進行測試。通過檢測Compound C對HepG2細胞的毒性作用。結果表明，5 μmol·L-1Compound C對HCC細胞的毒性作用較小，因此我們將此濃度作為下一步實驗的給藥濃度(Fig 6A)。與單獨用藥相比，阿司匹林聯合5 μmol·L-1Compound C治療HepG2細胞，HepG2細胞的存活數量明顯減少(Fig 6B)。此外，阿司匹林與Compound C聯用對HCC細胞克隆形成的抑制作用更加明顯(Fig 6C，D)。

Fig 6 Cell growth and clone formationsynergistically inhibited by co-treatment of aspirin and AMPK inhibitor Compound C (CC) n=3)

2.7 阿司匹林與Compound C聯合對HepG2細胞凋亡的影響接下來，我們觀察了阿司匹林與Compound C聯合對HepG2細胞凋亡的影響。研究發現，在阿司匹林濃度低至2.5mmol·L-1時，聯合治療也可明顯增加肝癌細胞凋亡(Fig 7A-D)。凋亡蛋白caspase-3的表達也證明了這個結果(Fig 7E-F)。這些數據表明阿司匹林和AMPK抑制劑聯合治療HCC比單獨使用阿司匹林療效更好。

Fig 7 Apoptosis induced by aspirin and Compound C on HCC cells n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

3 討論

長期小劑量服用阿司匹林可以明顯降低癌癥發病率，特別是胃腸道腫瘤[16]。一項超過26年的隨訪研究報告指出，長期規律服用小劑量阿司匹林與患HCC呈劑量依賴性降低，服用阿司匹林5年以上其療效明顯增加[17]。在本項研究中，我們發現阿司匹林可誘導HepG2細胞產生AMPK相關的自噬，從而對抗其對肝癌細胞的生長起到保護作用。采用阿司匹林聯合AMPK抑制劑可協同抑制HCC細胞增殖和單細胞克隆形成。

本研究采用DEN誘導的大鼠肝癌模型。我們發現，DEN組大鼠肝臟/體質量比明顯升高，而在阿司匹林組中大鼠的肝/體質量比沒有明顯差異(Fig 1A)。同時，阿司匹林治療組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，AMPK表達增加。這些數據表明，阿司匹林可誘導肝癌細胞自噬的產生。

自噬的主要調節蛋白是AMPK和mTOR，它促進細胞器和蛋白質的循環和/或降解，以維持細胞內穩態[18]。自噬在肝癌發生發展過程中如何積極調節細胞存活或誘導細胞凋亡仍有爭議。有報道指出，自噬促進肝癌細胞死亡[14],相反，另一些研究顯示，自噬可以維持肝癌細胞的存活[6, 9]。因此，自噬激活對肝癌細胞增殖和存活的影響可能與環境有關。前期研究表明，AMPK信號通路可調節阿司匹林的作用[9]。阿司匹林通過AMPK激活、mTORC1抑制和自噬誘導，抑制PIK3CA突變型乳腺癌細胞的活力和生長。在本研究中，我們發現阿司匹林誘導的自噬通過AMPK-mTOR信號通路促進HCC細胞存活。AMPK是細胞生存所必需的，其表達降低會降低前列腺癌細胞活力。因此，AMPK的激活對細胞增殖和存活的影響可能與環境有關。我們證明，在阿司匹林治療中，AMPK的激活可能通過上調自噬促進肝癌細胞增殖、克隆和存活。AMPK抑制劑Compound C明顯增強阿司匹林對細胞凋亡、細胞增殖和細胞克隆形成的抑制作用。這些結果表明AMPK/mTOR信號通路誘導的自噬削弱阿司匹林對肝癌細胞的抑制作用。

綜上，阿司匹林可通過激活AMPK誘導肝癌細胞自噬，而自噬的發生削弱了其抗癌作用。與單藥相比，阿司匹林聯合AMPK抑制劑可明顯降低腫瘤增殖和細胞克隆形成，并誘導細胞凋亡。阿司匹林聯合AMPK抑制劑可能是肝癌的有效治療方法。本研究為肝癌的臨床治療提供了新的思路。