miR-5088-5p在同型半胱氨酸致肝細(xì)胞焦亡中的保護作用研究

董小艷,劉達(dá)越,徐靈博,顧鈴毓,姜怡鄧,楊安寧,焦 運,李桂忠

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室、3.寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點實驗室、4.臨床醫(yī)學(xué)院、5.總醫(yī)院感染科，寧夏回族自治區(qū)，寧夏 銀川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)來源于蛋氨酸，其主要在肝臟中代謝，蛋氨酸代謝失調(diào)引起血漿中同型半胱氨酸積聚形成高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。研究表明，在肝臟脂肪變性患者血液樣本中血漿Hcy水平明顯升高，說明HHcy是肝臟疾病的重要危險因素[2]。同時，有學(xué)者認(rèn)為高遷移率族蛋白1通過組織蛋白酶V依賴途徑介導(dǎo)同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[3]。還有研究顯示，在非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等疾病中肝細(xì)胞焦亡水平明顯升高[4]，過多的細(xì)胞焦亡會導(dǎo)致細(xì)胞無菌性炎癥，加速肝損傷。可見細(xì)胞焦亡與肝臟疾病的進展密切相關(guān)，但在許多方面仍尚不清楚。miRNAs是一種18-24個核苷酸的非編碼RNA，可通過調(diào)控細(xì)胞焦亡參與肝臟代謝失調(diào)、肝損傷、肝纖維化和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，這使miRNAs的調(diào)控成為診斷和治療肝病的一個切入點[5]。故本研究目的是探討miR-5088-5p在Hcy致肝細(xì)胞焦亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國Scientific公司)；BS110S型精密天平(Sar-toriu公司)；5415D型微量臺式離心機(Eppendorf公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；普通PCR儀與qRT-PCR儀(耶拿公司)；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(P0013F，上海貝博生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液(2021472，812006，Gibco公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(AJ90851A，AJE1566A，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)；總RNA提取試劑盒(U9223，北京天根生物科技有限公司)；CBS+/-和CBS+/+美國Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)提供；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Hcy(STBJ0903，優(yōu)級純，德國Sigma公司)、miR-5088-5p上下游引物(S0626，Q1229，廣州銳博生物科技有限公司)； NLRP3(#10151，美國Cell Signaling Technology公司)；Caspase 1(AF5418，中國Affinity公司)；IL-1β(AF5103，購自中國Affinity公司)；內(nèi)參抗體β-actin(AC028，中國abclonal公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人源肝細(xì)胞株(HL-7702)購自上海名勁生物科技有限公司，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，次日用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基換液，當(dāng)細(xì)胞密度增長到70%-80%時用0、100 μmol·L-1Hcy干預(yù)，分為Control組、Hcy(100 μmol·L-1)組[1]、100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p NC組和100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p mimic組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2動物分組及飼養(yǎng) 4周齡體質(zhì)量約20 g的CBS小鼠購自美國Jackson實驗室，在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，隨機選取12只雄性基因正常小鼠(CBS+/+，n=6)和單基因敲除(CBS+/-，n=6)小鼠給予高蛋氨酸(2%高蛋氨酸)飲食，飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，溫度(22-25) ℃，濕度55%-65%，給飼養(yǎng)房環(huán)境定期紫外消毒，小鼠喂養(yǎng)12周之后處理用于后續(xù)實驗。

1.2.3Western blot測定焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將各組肝細(xì)胞裂解提取總蛋白，采用BCA試劑盒進行定量后，加入蛋白上樣緩沖液95 ℃煮沸5 min變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育兔抗鼠NLRP3抗體(1 ∶500)、兔抗鼠caspase 1抗體(1 ∶500)、兔抗鼠 IL-1β抗體(1 ∶500)過夜；PBST洗膜3次，每次8 min，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h時；PBST洗膜3次，每次8 min，配制ECL試劑化學(xué)發(fā)光液，顯影，β-actin作為內(nèi)參，計算NLRP3、Caspase 1與IL-1β灰度值用來分析。

1.2.4qRT- PCR檢測肝細(xì)胞中miR-5088-5p的表達(dá) 委托銳博生物科技有限公司設(shè)計合成miR-5088-5p的引物。根據(jù)RNA提取試劑盒提取肝細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min，37 ℃ 5 s，4 ℃保存。熒光定量PCR擴增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 34s，45個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線數(shù)據(jù)，按照公式2-△△Ct計算miR-5088-5p的含量，ΔΔCt=(Ct待測樣本目的基因-Ct待測樣本內(nèi)參基因)-( Ct校正樣本目的基因-Ct校正樣本內(nèi)參基因)。

1.2.5轉(zhuǎn)染miR-5088-5p至肝細(xì)胞 轉(zhuǎn)染方法：培養(yǎng)肝細(xì)胞至對數(shù)生長期，待細(xì)胞融合達(dá)到80%，在1.5 mL EP管中加入10 μL mimic/10 μL NC融到490 μL純RPMI 1640培養(yǎng)基中，混勻，10 μL Lipofectamine 2000融到490 μL純RPMI 1640培養(yǎng)基中輕輕吹勻，靜止5 min，再將混合轉(zhuǎn)染試劑和mimic稀釋液混合輕輕吹吸5次，室溫下靜止20 min，將上述轉(zhuǎn)染混合物加入培養(yǎng)瓶再加純RPMI 1640培養(yǎng)基補齊至4 mL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后換液用Hcy刺激48 h，嚴(yán)格根據(jù)說明書將miR-5088-5p模擬物和miR-5088-5p陰性對照轉(zhuǎn)染到HL-7702細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.6鑒定小鼠基因型 取小鼠腳趾，根據(jù)基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。選用巢式降落式特異性PCR反應(yīng)擴增DNA，擴增程序如下：95 ℃ 2 min 1×;95 ℃ 20 s 65 ℃ 15 s 68 ℃ 10 s, 10×;95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s 72 ℃ 10 s, 28×;72 ℃ 2 min, 1×;10 ℃保存，反應(yīng)結(jié)束后，配制2%瓊脂糖凝膠，140 V電泳20 min，顯影儀曝光，保存結(jié)果。

1.2.7檢測小鼠血清同型半胱氨酸水平 將小鼠麻醉后，稱體質(zhì)量，固定，眼球取血并5 000 r·min-1離心，收集上清，采用全自動生化儀檢測其血清中同型半胱氨酸的水平。

1.2.8采用免疫熒光染色檢測肝組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將石蠟切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脫蠟20 min，100%、95%、85%、75%、50%梯度酒精水化，抗原修復(fù)，自然冷卻至20 ℃，3%過氧化氫封閉之后，0.3% Triton X-100 室溫通透8 min，5%山羊血清封閉2 h，4 ℃環(huán)境下孵育一抗NLRP3(1 ∶50)、caspase 1(1 ∶150)和IL-1β(1 ∶200)過夜，PBS溶液清洗切片3次，每次6 min，滴加Cy3標(biāo)記的熒光二抗室溫下孵育2.5 h，洗片后滴加DAPI，封片熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞中NLRP3、Caspase 1和IL-1β 蛋白表達(dá)情況為了探討Hcy對肝細(xì)胞焦亡的影響，通過Western blot檢測焦亡相關(guān)蛋白，與Control組相比，Hcy組NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高(均P<0.01)，表明Hcy能夠促進肝細(xì)胞焦亡，見Fig 1。

Fig 1 Expression of NLRP3, Caspase-1 and IL-1β in hepatocytes detected by Western n=3)

2.2 肝細(xì)胞中miR-5088-5p表達(dá)水平為了驗證miR-5088-5p在Hcy致肝細(xì)胞焦亡過程中的變化，采用qRT-PCR檢測肝細(xì)胞中miR-5088-5p表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與Control組相比，Hcy組miR-5088-5p的表達(dá)水平降低(P<0.01)，提示miR-5088-5p可能參與Hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡，見Fig 2。

Fig 2 mRNA expression of miR-5088-5p in hepatocytes detected by

2.3 過表達(dá)miR-5088-5p后肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況為進一步研究miR-5088-5p在肝細(xì)胞焦亡中的作用，將miR-5088-5p mimic轉(zhuǎn)染至肝細(xì)胞，分為Control組，Hcy組，Hcy+NC組，Hcy+mimic組，采用Western blot檢測NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與Hcy組相比，Hcy+NC組NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白的表達(dá)無差異；與Hcy+NC組相比，Hcy+mimic組NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，表明miR-5088-5p過表達(dá)可以減少由Hcy引起的肝細(xì)胞焦亡的增加，見Fig 3。

Fig 3 Expression of NLRP3, caspase 1 and IL-1β Protein in hepatocytes after transfection of miR-5088-5p

2.4 鑒定CBS小鼠基因型及檢測小鼠血清Hcy水平為了驗證小鼠為基因敲除小鼠，進行CBS小鼠基因型鑒定，結(jié)果見Fig 4A，針對小鼠基因型設(shè)計特異性引物，采用普通PCR對基因敲除小鼠進行鑒定，其中，單條帶為CBS+/+小鼠，雙條帶為CBS+/-小鼠。同時采用全自動生化儀對小鼠血清同型半胱氨酸水平進行檢測，結(jié)果顯示，與CBS+/+組小鼠比較，CBS+/-組小鼠血清中Hcy濃度升高(P<0.01)，表明CBS小鼠模型復(fù)制成功，見Fig 4B。

2.5 免疫熒光檢測肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達(dá)水平為了明確Hcy引起焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，采用免疫熒光檢測肝組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白表達(dá)(見Fig 5A、C、E)并對小鼠肝臟組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的陽性面積進行定量分析，其中紅色代表NLRP3、caspase 1、IL-1β表達(dá)含量，藍(lán)色代表細(xì)胞核。結(jié)果顯示：與CBS+/+小鼠相比，CBS+/-組小鼠肝組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的陽性面積比例增加(P<0.01)，表明Hcy能夠促進焦亡相關(guān)蛋白在肝臟中表達(dá)，見Fig 5B、D、F。

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。Hcy的代謝途徑受復(fù)雜的酶系統(tǒng)調(diào)控，胱硫醚β合成酶(cystathionine b-synthase，CBS)是反式硫化途徑中的第一個酶，CBS催化同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，當(dāng)CBS的活性降低，Hcy不能夠充分的通過轉(zhuǎn)硫途徑轉(zhuǎn)換為胱硫醚，從而在體內(nèi)蓄積引起肝臟損傷[6-7]，同時升高的Hcy可促進肝細(xì)胞凋亡、肝臟纖維化等多種肝臟病變[8-9]。肝臟損傷又進一步導(dǎo)致Hcy的積累進而惡性循環(huán)。可見，Hcy與肝臟疾病關(guān)系密切。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Hcy可通過下調(diào)囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡，CFTR的表達(dá)下調(diào)在體內(nèi)外可促進自噬，加重肝損傷[10-11]。為了更進一步探討Hcy對肝損傷的影響，本實驗建立CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血癥模型后，肝臟組織免疫熒光結(jié)果顯示，肝細(xì)胞焦亡水平明顯增加。說明Hcy可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種獨特的程序性細(xì)胞死亡形式，其特征是DNA斷裂、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞腫脹且有大氣泡，以及細(xì)胞內(nèi)容物泄漏[12]。在細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑中，炎性小體起著重要作用。炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的一個組成部分，而NLRP3是最常見的炎癥小體之一。這種炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與炎癥性疾病有很強的聯(lián)系，在細(xì)胞、小鼠和人體樣本的實驗表明，一種特殊的細(xì)胞死亡形式—焦亡，會導(dǎo)致復(fù)雜的炎性顆粒NLRP3炎性小體從肝細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外空間后被其他細(xì)胞吸收，從而介導(dǎo)炎癥和促纖維化的應(yīng)激信號，這是新發(fā)現(xiàn)的一種肝損傷的新機制[13]。隨著我們對涉及細(xì)胞死亡的分子機制的不斷加深理解，我們對急性和慢性肝損傷如壞死、焦亡和自噬等各種細(xì)胞死亡模式有了更廣泛的認(rèn)識[14]。我們的結(jié)果表明，Hcy刺激肝細(xì)胞后，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白表達(dá)顯著增加，說明Hcy可以通過NLRP3炎癥小體形成來促進細(xì)胞焦亡。

miRNAs是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在肝臟疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。有學(xué)者研究表明，miR-21缺失抑制了小鼠和人類骨髓細(xì)胞中NLRP3和caspase 1的表達(dá)，促進NLRP3炎性小體激活，介導(dǎo)焦亡過程[16]。miR-5088-5p屬于miRNAs，因此本實驗重點關(guān)注miR-5088-5p的作用，經(jīng)Hcy刺激肝細(xì)胞后miR-5088-5p表達(dá)下調(diào)，當(dāng)過表達(dá)miR-5088-5p后，肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase 1、IL-1β表達(dá)下降，同時免疫熒光結(jié)果也證實了該現(xiàn)象，說明miR-5088-5p參與了Hcy引起的肝細(xì)胞焦亡，且對肝細(xì)胞焦亡有保護作用。目前，抑制焦亡的策略主要有兩種。一種是通過調(diào)控途徑抑制NLRP3炎癥體，例如，MCC950被稱為NLRP3抑制劑，可以有效減輕膽脂性肝損傷和膽管結(jié)扎小鼠模型的炎癥[17]。另一種策略是抑制NLRP3炎癥小體激活后的下游信號通路。本實驗發(fā)現(xiàn)miR-5088-5p能夠抑制Hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡，但具體機制有待進一步研究，未來研究方向我們會更加關(guān)注NLRP3炎癥小體激活后的下游信號通路分子的抑制劑來阻斷焦亡過程，為肝病的防治提供新的思路。