血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合可降解殼聚糖治療大鼠心肌梗塞的研究*

李延民 馮 艷 魏燕云 劉 靜 王獻忠 劉俊法 周 維

(邯鄲市第一醫(yī)院心內(nèi)二科，邯鄲 056000)

心肌梗塞(myocardial infaction，MI)的發(fā)生是因為冠狀動脈突然受到了持續(xù)的缺血缺氧危害從而引起的心肌壞死[1]。大多數(shù)MI患者在臨床上都表現(xiàn)出了胸骨后疼痛的癥狀，同時患者還表明了這種疼痛劇烈而持久[2]。除了疾病本身外，MI還能并發(fā)心律失常[3]、休克和心力衰竭[4]以及其他危急并發(fā)癥，并危及到患者的生命[5]。目前，在臨床上治療MI的方法主要還是直接冠狀動脈介入治療法(PCI)[6]，但是這種治療方法會在擴張阻塞血管的一瞬間引起心肌內(nèi)活性氧的激增，對心肌造成二次傷害。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有促進血管生成的作用[7-8]，有助于心肌的缺血區(qū)域建立新的側(cè)支循環(huán)，增加缺血區(qū)供血，在MI的治療中起到積極作用。根據(jù)曹雯等[9]介紹，可降解殼聚糖(DC)在37 ℃的環(huán)境中放置10～15 min就可以變?yōu)槟z凍狀，4～6周完全降解，VEGF可在此降解周期內(nèi)完全轉(zhuǎn)移至心肌細胞中發(fā)揮藥效。另一方面，DC還具有一定的對抗氧化應激的作用，從另一個方面對缺血心肌進行保護。本研究將VEGF與DC結(jié)合作為研究對象，將其注射到MI大鼠的梗塞邊緣區(qū)心肌內(nèi)，觀察MI大鼠的各項心功能指標，為可降解材料在治療MI的領(lǐng)域內(nèi)增加新的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(冀)2020-1-019。整個實驗過程中對實驗動物的操作均符合動物倫理學的標準，福利倫理審查編號：HDYYLLDW2020-K07。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉(Sigma)；0.9%氯化鈉注射液；4%多聚甲醛(北京博奧拓達科技有限公司)；VEGF(Cytolab)；DC(Pronova Biopolymer A.S.)。

1.3 儀器

小動物呼吸機(瑞沃德生命科技有限公司，型號：R407)；多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號：RM6240E)；PowerLab 4/35 四通道研究型高速記錄儀及Millar導管(ADINSTRUMENTS，型號：PL3504，型號：spr-320)；小動物超聲成像系統(tǒng)(Visual Sonics，型號：Vevo1100)。

1.4 動物分組

適應性飼養(yǎng)3 d后，32只SD大鼠被隨機分為假手術(shù)組、模型組、VEGF組和VEGF+DC組,n=8。各組實驗大鼠使用0.6%戊巴比妥鈉進行麻醉，給藥劑量為0.1 mL/100 g。麻醉后的大鼠連接呼吸機，開胸后對冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎以制造MI模型，其中假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。整個造模過程中大鼠需要監(jiān)測心電圖，實時記錄，并以心電圖的ST段抬高及左心室前壁心肌發(fā)白為造模成功的判定標準。造模后，對各組實驗大鼠進行分組給藥，假手術(shù)組和模型組在梗死邊緣區(qū)心肌處注射100 μL生理鹽水(0.9%)，VEGF組注射100 μL VEGF(2 μg/mL)溶液，VEGF+DC組注射100 μL 含VEGF(2 μg/mL)的DC溶液。給藥后將胸腔縫合，觀察大鼠待其恢復自主呼吸后將呼吸機撤除。

1.5 超聲心功能檢測

造模4周后大鼠進行超聲心功能檢測，按0.1 mL/100 g腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉。麻醉后的大鼠固定于恒溫鼠板上，雙下肢和右上肢涂抹導電膠，胸腹部進行脫毛，涂抹耦合劑進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果分別計算LVAW;s、LVAW;d、LIVID;s、LVID;d、LV Vol;s、LV Vol;d、EF%、FS%等指標。

1.6 血流動力學檢測

對超聲心功能檢測完畢的實驗動物直接進行血流動力學的檢測，方法為經(jīng)右頸總動脈將Millar導管插入到動物的左心室內(nèi)來測定各組實驗動物的左室舒張末壓(EDP)、+dp/dt和-dp/dt三個指標。

1.7 左心室指數(shù)(LVM/BW)計算

各組實驗動物的心功能檢測完成后將心臟取出，小心剪去心包膜、胸腺及冠狀動脈，生理鹽水沖洗后在結(jié)扎線處橫向中間切開分為上、下兩個部分，將這兩部分剪去右心室壁后一起稱質(zhì)量。下半部分保存于4%多聚甲醛用于HE染色。

1.8 HE染色

各組心肌均常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，HE染色。染色后的心肌切片通過顯微鏡觀察各組病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 超聲心功能檢測結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVID;s、LVID;d、LV Vol;s和LV Vol;d共4個指標均顯著上升；LVAW;s、LVAW;d、EF及FS共4個指標均顯著下降。這些指標的變化趨勢共同反映了模型組大鼠因為MI而導致的心功能低下。同時，相較于模型組，VEGF和VEGF+DC組大鼠的各項心功能指標均有不同程度的改善。詳見圖1、圖2及表1。

圖1 超聲心功能檢測Fig.1 Ultrasonic cardiac function test

圖2 心功能指標變化柱狀圖注：與假手術(shù)組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001Fig.2 Histogram of changes in cardiac functionNote:Compared with the sham operation group,###P<0.001；Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表1 心功能指標變化Table 1 Changes in cardiac function

2.2 血流動力學檢測結(jié)果

模型組大鼠的EDP值與假手術(shù)組相比呈現(xiàn)顯著的上升趨勢；同時+dp/dt和-dp/dt值呈顯著下降趨勢。VEGF組和VEGF+DC組與模型組相比，各指標均顯示不同程度的改善并且VEGF+DC組的改善效果要優(yōu)于VEGF組。詳見圖3及表2。

圖3 血流動力學變化注：與假手術(shù)組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001Fig.3 Hemodynamic changesNote: Compared with the sham operation group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表2 血流動力學變化Table 2 Hemodynamic changes

2.3 LVM/BW計算結(jié)果

如圖4及表3所示，模型組大鼠LVM/BW顯著高于假手術(shù)組，經(jīng)過VEGF及VEGF+DC的4周治療，MI大鼠的左心室指數(shù)顯著降低，且VEGF+DC組降低更為顯著。

圖4 左心室指數(shù)變化注：與假手術(shù)組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001Fig.4 Left ventricular index changesNote：Compared with the sham operation group,###P<0.001;Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表3 LVM/BW變化Table 3 Left ventricular index changes

2.4 HE染色病理結(jié)果

如圖5所示，假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，未出現(xiàn)空泡化，無核固縮現(xiàn)象；模型組心肌細胞分布散亂無章，出現(xiàn)細胞空泡化現(xiàn)象且有明顯的核固縮，說明心肌發(fā)生嚴重壞死現(xiàn)象；VEGF組對比模型組心肌細胞排列較為整齊，有核固縮減輕，無細胞空泡化；VEGF+DC組有大量心肌細胞呈整齊排列，治療效果好于VEGF組。

圖5 HE染色(×200)Fig.5 HE Staining(×200)

3 討論

隨著人口老齡化，心血管疾病已經(jīng)嚴重威脅人類的健康，其中心力衰竭以及MI是造成較高病死率的主要原因。MI后的心室壁會變薄，發(fā)生的各種炎癥反應會導致心肌形成瘢痕組織，進而發(fā)展為左室壁重塑，最終形成心力衰竭，這是一種嚴重且不可逆的變化。因此，MI后迅速而有效地建立側(cè)支循環(huán)對改善梗死區(qū)血液供應和梗死區(qū)心肌的存活有著積極的意義[10]。

VEGF是由Senger[11]在腫瘤細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，因其能増加毛細血管通透性而被命名為血管通透性因子(vascular permeability factor，VPF)。隨后在1989年，另一個研究組在牛垂體濾泡狀細胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)一種具有誘導血管生成作用的分泌型生長因子，并將其cDNA測序，測出的cDNA序列與Senger研究組發(fā)現(xiàn)的VPF的cDNA序列相同，編碼的蛋白完全相同，此后統(tǒng)一稱為VEGF[12]。VEGF與其他多種生長因子同樣都具有促進血管新生的功能，而VEGF是目前公認的特異性最強且活性最強的直接促進血管新生的生長因子[13]。因為VEGF不僅能促進在現(xiàn)有血管的基礎(chǔ)上形成新的血管，還能促進血管從的新生以及動脈的生成[14]。其機制在于VEGF刺激內(nèi)皮細胞，使其分裂增生形成突起的幼芽，這種作用會隨著內(nèi)皮細胞一起向前移動從而形成一條細胞索；細胞索繼續(xù)分裂增生形成管腔，也就是新生的毛細血管，各毛細血管彼此吻合就構(gòu)成了新的毛細血管網(wǎng)。

近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)了一種新型的可降解的材料，他們將甲殼類動物的外殼經(jīng)過脫?；幚砗笮纬闪司€性結(jié)構(gòu)的糖類，因此將這種材料稱為殼聚糖。2009年，Lu等[15]為研究殼聚糖將其與胚胎干細胞混合，并將混合溶液通過注射的方式對MI的邊緣區(qū)心肌進行給藥，治療4 周后對實驗動物進行超聲心功能檢測，檢測結(jié)果顯示該組實驗動物的LVID;s、LVID;d、左室射血分數(shù)(EF%)及短軸縮短率(FS%)均得到了不同程度改善，同時MI面積和室壁的厚度相較于對照組也呈現(xiàn)下降趨勢。除各心功能指標的提升外，該組大鼠在移植區(qū)內(nèi)還檢測到了大量的新生血管，這些新生的血管為細胞提供了豐富的營養(yǎng)，使得細胞得以存活。在此藥效學實驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上Liu等[16]對殼聚糖的機制進行了研究。眾所周知，MI發(fā)生的瞬間心肌會產(chǎn)生大量的活性氧，這種活性氧會導致受損心肌受到二次傷害，對移植入的干細胞也有一定損害。Liu等[16]的研究結(jié)果表明活性氧可以被殼聚糖有效的清除，使得細胞生存的環(huán)境得以改善，幫助了細胞在惡劣環(huán)境中得以存活。因為殼聚糖發(fā)現(xiàn)的時間并不長，所以目前對它的研究并沒有很多，但是根據(jù)現(xiàn)有的研究我們可以知道，將殼聚糖作為一種新型材料應用在醫(yī)學領(lǐng)域具有不良反應少，且應用范圍廣的優(yōu)點，所以在未來殼聚糖會有很好的發(fā)展前景。

本研究結(jié)果表明VEGF對大鼠的MI具有一定的改善作用，當VEGF與DC結(jié)合后，MI大鼠的心功能較單用VEGF組相比更為顯著，這說明了DC可以加強VEGF對MI的改善作用。因此，DC在MI治療中發(fā)揮輔助作用，這為以后MI的治療打開了新的視角。