MAOA在誘導前列腺癌神經內分泌分化中的作用*

稅 雪 許 榮 謝清華 張彩勤 譚鄧旭 師長宏 趙菊梅

(1. 延安大學醫學院，延安 716000)(2. 空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種雄激素驅動的疾病，它依賴于配體介導的雄激素受體(androgen receptor，AR)激活從而促進疾病進展[1]。盡管雄激素剝奪可以有效控制腫瘤生長，但大多數患者最終會發展成為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[2]。Watson等[3]、Parker等[4]以及Hussain等[5]研究表明，大多數CRPC仍依賴于AR信號通路，一些新型的AR通路抑制劑(androgen receptor inhibitor，ARPI),如：恩雜魯胺(enzalutamide，ENZ)和阿比特龍作為治療藥物應用于晚期前列腺癌患者以延長生存期。Nadal等[6]和Bishop等[7]報道，ARPI會誘導神經內分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer，NEPC)，出現特征性多器官轉移，導致難以治愈。目前，ARPI引起PCa神經內分泌分化(neuroendocrine transdifferentiation，NED)的確切分子機制尚未完全闡明，主要原因是缺乏模擬臨床特征的異質性轉化模型。因此，構建NEPC轉化模型已成為PCa防治研究亟待解決的重大問題。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A，MAOA)是一種位于線粒體上的氧化還原酶，通過氧化脫氨催化膳食胺和單胺神經遞質降解，產生副產物過氧化氫，即活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要來源[8-10]。Trachootham等[11]報道，ROS可使細胞發生氧化損傷，進而導致腫瘤的發生和發展。Wu等[12]、Liao等[13]及Li等[14]研究證實MAOA表達水平的升高會促進PCa細胞發生上皮—間質轉化，誘導癌細胞干性等。目前，MAOA對ENZ誘導NED的影響還未見報道。因此，本研究擬通過ENZ誘導建立NEPC細胞模型和動物模型，探索MAOA在該誘導過程中發揮的作用及潛在機制，旨在為揭示 NEPC的發生機制提供良好的模型，為PCa的治療提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：本研究選用15只6～7周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠，體質量22～25 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，在空軍軍醫大學實驗動物中心SPF環境中飼養和繁殖，實驗動物使用許可證號：SYXK(陜)2018-001。動物實驗通過空軍軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準，動物倫理證書編號：20190207。

1.1.2細胞：人前列腺癌細胞C4-2和22RV1購自國家實驗細胞資源共享平臺。細胞培養條件為RPMI-1640培養基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素)，37 ℃、5% CO2孵箱中培養。

1.1.3試劑：RPMI-1640培養基和0.05%胰酶購自HyClone；FBS購自浙江天杭生物科技股份有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Western blot制膠試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；MAO-Glo試劑盒購自Promega;熒光定量PCR等分子生物相關試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。抗體：神經內分泌標志物抗體(CGA和SYP)和前列腺癌特異性抗體(PSA和AR)均購自Abcam；神經內分泌標志物抗體ENO2抗體購自ProMab；Actin抗體和二抗購自康為世紀生物科技股份有限公司。藥品：ENZ購自Selleck；MAOA特異性抑制劑氯吉靈(clorgyline,CLG)購自MCE；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.1.4儀器：酶標儀購自Biotek Take；基因擴增儀購自Eppendorf；Real-time PCR購自StepOne Plus、Thermo Fisher等。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和Real-time PCR：使用TRIzol破碎和溶解細胞， 收集總RNA。使用逆轉錄酶逆轉錄獲得cDNA。使用 Step One Plus 實時 PCR 檢測系統(Thermo Fisher ABI)，PrimeScriptTMRT 試劑盒和 TB Green? Fast qPCR Mix(Takara)進行Real-time PCR實驗，95 ℃聚合酶激活3 min，然后進行40個循環的兩步法PCR(95 ℃、30 s和60 ℃、40 s)，最終PCR反應結束后直接進行熔解曲線分析。使用2-ΔΔCT方法計算mRNA的相對表達水平，β-actin作為內參。

1.2.2免疫印跡分析：細胞或破碎后瘤體組織，使用RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液，使用BCA法進行蛋白定量。蛋白在10% SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉移到PVDF膜上并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。特異性一抗4 ℃孵育過夜，酶標二抗室溫2 h后，通過ECL試劑盒觀察細胞膜上的信號。β-actin作為內參。

1.2.3MAOA活性分析：熒光素酶裂解緩沖液裂解1×104個細胞，MAO-Glo試劑盒分析細胞裂解液的MAOA活性，MAO-Glo檢測系統記錄熒光信號值[15]。

1.2.4MTT法檢測各細胞株耐藥指數：將2×103/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，使用100 μL含有不同濃度的ENZ培養基培養細胞96 h后，向每孔加入培養基/ CCK8混合物(9∶1)，繼續孵育2.5 h，用酶標儀檢測，于450 nm處讀取吸光度值。

1.2.5體內實驗：所有小鼠均接受手術去勢，于一周后右側皮下植入1 × 106個22RV1細胞，建立異種移植模型。腫瘤體積=1/2 ×(長軸 × 寬軸)2。當腫瘤體積達到100 mm3，將小鼠隨機分為三個治療組，A組：對照組(22RV1)、B組：10 mg/kg的ENZ每日灌胃(22RV1+ENZ)及C組：10 mg/kg ENZ+10 mg/kg 的CLG，每日腹腔注射(22RV1+ENZ+CLG)，n=15。治療兩周后視為實驗終點，對所有荷瘤小鼠CO2窒息處死，并取組織用于免疫組化分析。

1.2.6免疫組化：小鼠腫瘤組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm切片，通過間接免疫過氧化物酶技術進行免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察出現背景清晰的棕色或棕黃色顆粒判為陽性染色。

2 結果

2.1 ENZ誘導的NEPC模型建立與表征

為了選擇適合NED研究的PCa細胞系，對PCa細胞系C4-2和22RV1對AR抑制劑的敏感性進行了評估。MTT檢測結果顯示，C4-2細胞對ENZ敏感，22RV1細胞對ENZ不敏感(圖1A)，因此選擇C4-2細胞進行 10～20 μmol/L ENZ連續誘導培養4個月，以期獲得神經內分泌樣的細胞。結果如圖1B所示，與親本相比，ENZ處理的C4-2細胞能在更高濃度的藥物中增殖，耐受濃度從34.64 μmol/L升高至82.17 μmol/L。同時，細胞形態發生明顯改變，呈現突觸增多、胞體聚集等神經樣細胞表型(圖1C)。因此，將ENZ耐藥細胞株C4-2命名為C4-2ENZR。Western blot結果表明，與親本細胞相比，C4-2ENZR細胞中NE標志物嗜鉻粒蛋白A(CGA)、突觸素(SYP)和神經元特異性烯醇化酶(ENO2)的蛋白表達增加，腺癌標志物雄激素受體(AR)表達降低(圖1D)。這表明該細胞模型為NEPC模型[7]。

圖1 NEPC模型的建立注：***P<0.001Fig.1 Establishment of NEPC modelNote：***P<0.001

2.2 NEPC細胞模型中MAOA表達升高

根據Wu等[12]報道，MAOA的表達與PCa的惡性程度相關,因此使用Oncomine數據庫分析MAOA在兩個不同臨床隊列的表達。結果顯示，與正常前列腺組織相比，人類PCa組織中MAOA的表達更高，且與Gleason評分呈正相關(圖2A)。進一步通過RT-PCR和Western blot檢測發現，與親本C4-2細胞相比，C4-2ENZR細胞中MAOA的mRNA和蛋白的表達顯著升高(圖2B、圖2C)，從而驗證了上述生物信息學結果，即：MAOA可能在ENZ誘導的NED中起關鍵作用。

圖2 MAOA的表達與ENZ誘導的神經內分泌分化有關注：*P<0.05，**P<0.01Fig.2 The expression of MAOA is associated with the development of NED induced by ENZNote：*P<0.05, **P<0.01

2.3 MAOA抑制劑CLG可以延緩ENZ引起的NED發生

CLG作為一種選擇性抑制劑，可以顯著降低MAOA酶的活性(圖3A)。對C4-2細胞進行ENZ給藥時，同時添加1 μmol/L的CLG聯合處理細胞2個月后檢測發現，ENZ與CLG聯合使用可以減輕ENZ所引起的神經內分泌樣細胞形態學改變，并抑制神經內分泌標志物NCAM1和ENO2表達(圖3B、圖3C)。這表明MAOA是促進NED和維持神經內分泌細胞特性的關鍵因素，以MAOA為靶點的抑制劑CLG可以延緩ENZ引起的NED的發生。為了進一步證實體外細胞系研究的結果，建立了22RV1裸鼠異種移植模型，結果顯示ENZ確實可以誘導NEPC體內模型形成，該模型表現出超高水平的神經內分泌標志物陽性表達。更重要的是，與ENZ單藥治療的腫瘤相比，ENZ+CLG聯合使用能夠降低22RV1小鼠腫瘤中的神經內分泌標志物表達(圖3D)。

圖3 MAOA抑制劑CLG可以顯著延緩體內和體外的NED注：***P<0.001Fig.3 Clorgyline, inhibitors of MAOA, can significantly delay NED in vivo and in vitroNote：***P<0.001

2.4 靶向MAOA抑制缺氧信號以克服NED

缺氧是多種實體瘤的常見情況，Lu等[16]研究發現，缺氧可以促進ROS的產生，從而促進疾病進展。Shih等[10]證實，MAOA介導的酶促反應產生大量作為ROS主要來源的過氧化氫。因此，流式分析C4-2、C4-2+ENZ 和C4-2+ENZ+CLG細胞的ROS水平。如圖4所示，MAOA刺激ROS的產生，由26.5%增至48.8%；CLG延緩ROS的升高，使其降為40.3%。以上結果提示，MAOA可以通過改變C4-2細胞中的缺氧信號來克服ENZ引起的NED。

圖4 MAOA 激活缺氧信號以促進 NEDFig.4 MAOA triggers hypoxia signaling to promote the NED

3 討論

PCa是老年男性患者死亡的主要原因之一，NEPC屬于PCa的終末階段，侵襲性強且預后極差[17]。目前NEPC的研究進展緩慢，主要是缺乏模擬臨床特征的異質性轉化模型[18]。因此， NEPC模型的構建是本研究的關鍵。通過ENZ構建具有神經內分泌特征的NEPC體外模型C4-2ENZR，該細胞模型高表達SYP，CGA和ENO2，低表達AR，為典型的NEPC細胞。體內模型選取22RV1細胞系，相比于C4-2細胞，22RV1細胞在裸鼠體內具有較好的成瘤率，并且對ENZ表現出耐藥性，更接近于NEPC特征[7,19]。本研究將22RV1移植入去勢小鼠體內建立異種移植模型，進一步用ENZ誘導并經組化染色證實，神經內分泌標志物SYP表達強陽性，提示該模型具有NEPC特征。以上模型的成功建立為后續分子機制研究提供了堅實基礎。

目前，ENZ引起NED的具體機制仍不完全清楚。Luo等[20]發現LncRNA-p21調節EZH2/STAT3信號通路改變ENZ誘導的PCa NED。Bishop等[7]也發現主神經轉錄因子(BRN2)是AR抑制后NEPC形成的主要驅動基因，但MAOA與NEPC的關系尚未見報道。此外，目前除化療外，尚無針對NEPC患者的有效治療方法。一些靶向抑制劑，如EZH2抑制劑GSK126[21]，AR降解增強劑ASC-J934[21-23]等被證明能起到一定的治療效果，但多處于臨床前研究或臨床試驗階段，距離新藥上市時間較長。因此，重新利用現有藥物是解決這些問題的有效方法。

現有的抗抑郁藥物CLG可有效抑制MAOA的活性，Wu等[15]發現CLG可以擾亂導致癌細胞侵襲和增殖的信號通路，進而抑制PCa進展。同樣，本研究也證實，在晚期PCa中，靶向MAOA可能是抑制PCa進展的潛在治療策略，結果表明(1)ENZ處理后，MAOA的活性和表達量增加，提示MAOA可能在ENZ誘導的NED中起關鍵作用；(2)MAOA升高可以促進神經神經內分泌標志物的表達，并且可能通過改變下游缺氧信號通路實現的。最重要的是，證明CLG可以有效延緩ENZ引起的NED。

綜上所述，本研究證實，MAOA是促進NED和維持神經內分泌細胞特性的關鍵因素，現有的MAOA抑制劑CLG可以延緩NEPC發生。將CLG與ENZ聯合使用，有可能成為PCa患者的新型治療方案。