液相質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定復(fù)方甘草片中甘草酸和嗎啡

李冬云，韋夢(mèng)秋

（1. 玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 玉林 537000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

復(fù)方甘草片是臨床上常用的祛痰鎮(zhèn)咳復(fù)方制劑，由甘草浸膏粉、阿片粉或罌粟果提取物粉、樟腦、八角茴香油與苯甲酸鈉制成[1-3]。復(fù)方甘草片作為基本藥物，收錄于《中國藥典》2020年版二部，方法中分別對(duì)嗎啡和甘草酸進(jìn)行含量測定，均使用液相色譜儀，因基質(zhì)復(fù)雜的緣故，嗎啡的含量測定方法中需用固相萃取法（SPE）進(jìn)行前處理，洗脫過程復(fù)雜耗時(shí)，可能導(dǎo)致洗脫不完全；甘草酸含量測定方法操作較簡便，但常出現(xiàn)甘草酸峰與其他成分峰難以分離的情況[4-5]。本文建立了液相質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定復(fù)方甘草片中嗎啡和甘草酸的含量，此法前處理簡便，準(zhǔn)確，快速，能有效用于該藥品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào)：Xevo-TQSmicro，美國沃特世公司），十萬分之一電子分析天平（型號(hào)：XS-205DU，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）,數(shù)控超聲波清洗器（型號(hào)：KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 復(fù)方甘草片（桂林南藥股份有限公司，批號(hào)CG190714；國藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，批號(hào)：20190724，20191220）；甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：RJ171229-15，Stanford Chemicals公司）；嗎啡對(duì)照品（批號(hào)：171201-200822，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；超純水由Millipore超純水儀制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Hilic Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈-15 mmol/L乙酸銨（50:50，v/v），流速0.25 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量 5 μl。

1.2.2 質(zhì)譜條件 ESI+，毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化器壓力35 psi，干燥器溫度300 ℃，干燥器流速12 L/min，化合物質(zhì)譜詳細(xì)條件見表1。

表1 目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 溶液的配制

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草酸對(duì)照品48.75 mg、嗎啡對(duì)照品11.08 mg分別置入50 ml量瓶，加甲醇，搖勻，作為各自的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，精密量取甘草酸儲(chǔ)備液5 ml、嗎啡儲(chǔ)備液1.25 ml置入同一25 ml量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得每1 ml含有甘草酸191 μg、嗎啡11.08 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 取批次為CG190714的復(fù)方甘草片20片，稱重，研細(xì)，稱取相當(dāng)于1片的量置于100 ml量瓶，加甲醇-水（1:1）適量，超聲提取處理（300 W，250 kHz）20 min，取出冷卻，用甲醇-水（1:1）定容至刻度，搖勻，過濾，精密量取1 ml置于20 ml量瓶，用甲醇-水（1:1）稀釋至刻度，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

1.2.3.3 陰性樣品溶液制備 取不含甘草酸和嗎啡的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液，無干擾。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，對(duì)照品溶液中的嗎啡與甘草酸MRM圖譜及陰性樣品的MRM圖譜見圖1。

圖1 嗎啡與甘草酸MRM圖譜

2.1.2 線性與范圍 吸取“1.2.3.1”項(xiàng)中的混合對(duì)照品溶液0.10，0.20，0.40，0.80，1.00 ml置入10 ml量瓶，然后加甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，依照“1.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣5 μl，以咖啡與甘草酸的響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，以含量（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，得回歸方程如下

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取線性中混合對(duì)照品溶液的第3個(gè)濃度點(diǎn)，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測得甘草酸峰響應(yīng)值為 58 443，57 652，57 886，58 412，58 069，58 613，RSD為0.64 %；嗎啡響應(yīng)值為9424，9376，9298，9412，9408，9351，RSD為0.51 %，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取供試品（批號(hào)：CG190714），按“1.2.3.2”項(xiàng)方法制備1份供試品溶液，按照選定的色譜、質(zhì)譜條件分別在供試品溶液制備后0、4，8，12，16，20和24 h進(jìn)樣5 μl，測得甘草酸響應(yīng)值為：48 052，47 599，47 682，47 623，47 084，47 312，47 146，RSD為0.72 %；測得嗎啡響應(yīng)值為：4562，4531，4539，4567，4550，4512，4518，RSD為0.46 %，結(jié)果表明，試驗(yàn)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品（批號(hào)：CG190714）的樣品6份，按“1.2.3.2”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按照選定的色譜、質(zhì)譜條件測得甘草酸含量為10.757，10.756，10.593，10.601，10.787，10,848 mg/片，RSD為0.97 %；嗎啡含量為0.363，0.370，0.374，0.364，0.368，0.360 mg/片，RSD為1.4 %，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取供試品（批號(hào)：CG190714）的樣品6份，精密加入甘草酸單標(biāo)儲(chǔ)備液4 ml、嗎啡單標(biāo)儲(chǔ)備液1 ml，按照“1.2.3.2”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按照選定的色譜、質(zhì)譜條件測定，甘草酸回收率為：95.9 %，98.0 %，97.7 %，93.5 %，95.6 %，98.1 %，平均值為96.5 %，RSD為1.86 %；嗎啡回收率為：105.6 %，106.5 %，104.7 %，107.4 %，103.8 %，102.0 %，平均值為105.0 %，RSD為1.90 %。

2.2 樣品含量測定

分別取不同廠家、批次復(fù)方甘草片20片，按照1.2.3項(xiàng)下的方法制備，按照選定的條件進(jìn)樣，樣品含量見表3。

3 討論

3.1 2020年版《中國藥典》利用嗎啡的酸堿兩性，先加入稀鹽酸使其成酸性，然后再利用氨水堿化，使嗎啡能在固相萃取小柱保留，最后利用酸化的甲醇洗脫收集，操作步驟復(fù)雜。本方法用甲醇直接超聲提取，無轉(zhuǎn)移過程，簡化了前處理步驟也降低了處理成本。

3.2 通過對(duì)嗎啡對(duì)照品前體離子掃描得到嗎啡加合離子[M+H+][6-7]，m/z 286.3，在不同碰撞能量下均產(chǎn)生m/z 165.0和m/z 181.1。經(jīng)過工作站MS條件優(yōu)化處理，在碰撞能量20 V時(shí)，兩個(gè)子離子的離子相對(duì)豐度最高，且m/z 165.0高于m/z 181.1，故確定m/z 286.3/165.0為定量離子對(duì)，m/z 286.3/181.1為定性離子對(duì)。同法操作，甘草酸銨對(duì)照品在同樣掃描處理過程中產(chǎn)生的定量離子對(duì)為m/z 823.9/453.5，定性離子對(duì)為m/z 823.9/189.0[8-9]。

3.3 由于嗎啡在樣品中含量低，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為0.36～0.44 mg/片，且紫外檢測容易受其他成分干擾，所以樣品前處理需要固相萃取，增加了前處理步驟的復(fù)雜性和可操作性難度。液相色譜電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)樸靈敏度高、選擇性高和多離子檢測模式（MRM）定量準(zhǔn)確[10-11]，因此，利用現(xiàn)有先進(jìn)設(shè)備建立更簡便、高效、準(zhǔn)確的檢測方法對(duì)藥品生產(chǎn)企業(yè)提高質(zhì)量控制能力和藥品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)提高效率方面意義重大。

4 結(jié)論

本文采用液相質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測定復(fù)方甘草片中的甘草與嗎啡含量，前處理簡單，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確，為復(fù)方甘草片及含甘草、嗎啡的藥物制劑等質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。