注射用左旋泮托拉唑鈉的遺傳毒性研究

高 梅，馬 會，曹 沖，英 永，張岱州＊

（1. 山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101；2. 山東師范大學 生命科學院，山東濟南 250014）

泮托拉唑是質子泵抑制劑，研究表明，泮托拉唑能有效抑制胃酸分泌，主要用于治療幽門螺桿菌感染，十二指腸潰瘍，胃潰瘍，中、重度反流性食管炎等[1-2]。左旋泮托拉唑鈉是泮托拉唑鈉的 -構型光學異構體鈉鹽，在中性和弱酸性條件下相對穩定，與消旋體泮托拉唑鈉相比，左旋泮托拉唑鈉具有代謝半衰期長、血漿蛋白結合率高、生物利用度高、療效好、毒副作用低等特點[3-5]，因此開發左旋泮托拉唑鈉不同制劑具有較大的社會和經濟意義。目前對左旋泮托拉唑鈉的制劑研究、藥效學、毒理學研究較多[6-12]，但未見對其遺傳毒性的研究。本研究根據《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》[13]，選用Ames試驗、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗、體內微核試驗3項標準試驗組合，評價了注射用左旋泮托拉唑鈉的遺傳毒性，以期為臨床安全用藥提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 試驗系統

鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA 1 5 3 5和TA 1 0 2購自美國M O L E C U L A R TOXICOLOGY,INC。中國倉鼠肺細胞（CHL細胞）購自中國科學院上海生命科學研究院。SPF級昆明小鼠50只，雄性，體重30～40 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，試驗在屏障環境動物實驗設施內進行，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2018 0031。

1.2 主要儀器

AUY220電子天平（日本島津有限公司）；SPX-250B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；HFsafe-1500TE生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；BC-J160S CO2細胞培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；尼康80i生物顯微鏡（Nikon公司）。

1.3 藥品與試劑

注射用左旋泮托拉唑鈉；4-硝基喹啉-N-氧化物（Sigma）；2-氨基芴（Sigma）；1,8-二羥基蒽醌（Sigma）；環磷酰胺（Sigma）；絲裂霉素C（Roche）；疊氮鈉（山東西亞化學股份有限公司）；RPMI Medium 1640 basic培養基（Gbico）；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；肝微粒體酶（S9）（Molecular Toxicology, Inc）。

2 方法與結果

2.1 方法[13-15]

2.1.1 Ames試驗 選用組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA1535和TA102 5種菌株組合，對其分別進行基因型特性鑒定，鑒定合格后用于試驗。試驗設計5個劑量，高劑量組有一定的細菌毒性，給藥劑量分別為5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿，每組3個平行皿，同時設溶媒對照組和陽性對照組。試驗在加S9和不加S9平行條件下進行，S9在S9混合液中的濃度為10 %（v/v），采用標準平板摻入法，加藥后37 ℃培養箱培養48 h后觀察結果并計數。

2.1.2 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗 采用中國倉鼠肺細胞，熒光顯微鏡檢查無支原體污染，核型檢查畸變率<5 %。CHL細胞接種于25 cm2細胞培養瓶，置37 ℃、5 % CO2培養箱中培養。加和不加S9條件下，受試物分別染毒6 h，高、中、低劑量分別為200，100，50 μg/ml，不加S9條件下，受試物染毒24 h，高、中、低劑量分別為140，70，35 μg/ml，同時設相應的溶媒對照組和陽性對照組。各組收獲前3～4 h加入秋水仙堿溶液，制備染色體標本。油鏡下各組至少觀察300個分散良好的分裂中期相細胞，記錄含有結構畸變染色體的細胞數，計算畸變率。

2.1.3 小鼠骨髓微核試驗 采用昆明小鼠，給藥起始年齡6～8周齡，雄性，受試物高、中、低劑量分別為140，70，35 mg/kg，同時設立溶媒對照組、陽性對照組（環磷酰胺，50 mg/kg）。溶媒對照組、受試物各劑量組靜脈注射給予相應給藥制劑，陽性對照組腹腔注射給藥，均給藥1次，給藥24 h后及給藥后48 h前分別采樣制備骨髓涂片。每只動物至少計數500個骨髓嗜多染紅細胞以確定未成熟紅細胞[嗜多染紅細胞（PCE）]占總紅細胞[未成熟紅細胞和正染紅細胞（NCE）]的比例。每只動物至少計數4000個未成熟紅細胞以測定未成熟紅細胞的微核率。

2.1.4 數據處理 試驗數據進行平均數和標準差的計算，以均值±標準差（±s）表示，用SPSS軟件統計分析。P>0.05表示差異無統計學意義，P<0.05表示差異有統計學意義。

2.2 結果

2.2.1 Ames試驗 在加S9和不加S9條件下，溶媒對照組中各試驗菌株回復突變菌落數均在正常范圍內，陽性對照組各菌株回變菌落數均高于溶媒對照組（P<0.05），表明試驗系統可靠。注射用左旋泮托拉唑鈉5000 μg/皿對菌株有顯著毒性作用（P<0.05），2500 μg/皿有輕微毒性作用（P<0.05），1250，625和312.5 μg/皿無抑菌作用（P>0.05）。各劑量組回變菌落數與溶媒對照組相比均無顯著性增加，且未呈現濃度依賴性增加，表明注射用左旋泮托拉唑鈉無誘導鼠傷寒沙門菌基因突變作用，鼠傷寒沙門菌回復突變試驗為陰性。結果見表1。

表1 注射用左旋泮托拉唑鈉鼠傷寒沙門菌回復突變試驗結果（±s，n=3）

表1 注射用左旋泮托拉唑鈉鼠傷寒沙門菌回復突變試驗結果（±s，n=3）

注：*P<0.05 vs 溶媒對照組

組別 劑量/μg·皿-1 S9 回變菌落數TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535溶媒對照組 / - 109.3±9.1 27.7±4.7 110.7±11.6 251.3±17.2 10.7±1.5+ 109.7±9.9 28.7±5.5 112.7±10.5 264.3±14.2 14.3±2.5陽性對照組 / - 389.3±48.2* 318.3±21.0* 1261.3±151.2* 1189.3±75.6* 1144.0±144.2*+ 1293.3±189.7* 1269.3±136.1* 1234.7±114.4* 829.3±60.0* 344.0±34.9*注射用左旋 312.5 - 108.3±12.7 24.0±3.5 109.3±7.5 259.7±15.0 9.3±1.5泮托拉唑鈉 + 114.0±7.9 25.0±4.4 1.0±8.2 265.0±16.5 13.7±3.1 625 - 107.7±9.0 25.7±3.2 109.7±13.4 256.7±11.2 11.3±2.5+ 112.0±13.0 24.0±4.6 110.7±13.4 253.3±20.7 13.0±2.0 1250 - 108.3±9.9 23.0±3.0 118.0±17.8 248.0±15.0 11.3±2.3+ 111.7±13.0 28.3±5.9 117.0±14.4 260.7±24.4 12.7±2.1 2500 - 96.0±7.0 19.3±3.1* 76.3±12.7* 250.0±18.5 8.0±1.0+ 100.3±10.4 23.3±3.3 84.7±7.5* 258.0±18.7 8.3±1.5*5000 - 60.7±9.1* 13.0±2.0* 25.0±4.6* 210.0±12.8* 3.7±0.6*+ 62.3±4.9* 14.3±2.1* 28.0±5.0* 212.7±14.4* 4.3±1.2*

2.2.2 體外染色體畸變試驗 在加S9和不加S9條件下，染毒6 h和24 h，溶媒對照組染色體畸變數均<5 %，陽性對照組絲裂霉素、環磷酰胺誘發產生的畸變率均>20 %，溶媒對照組畸變率與陽性對照組比較有顯著性差異（P<0.05），表明試驗系統可靠。在加S9和不加S9條件下，注射用左旋泮托拉唑鈉在50，100，200 μg/ml劑量下作用6 h；在不加S 9條件下，3 5，7 0，140 μg/ml劑量作用24 h，各劑量染色體畸變率均<5 %，與相對應的溶媒對照組比較無顯著性差異（P>0.05），且未呈現劑量反應關系，表明注射用左旋泮托拉唑鈉無誘導CHL細胞染色體畸變作用，體外染色體畸變試驗結果判定為陰性。結果見表2。

表2 注射用左旋泮托拉唑鈉體外染色體畸變試驗結果

2.2.3 小鼠體內微核試驗 陽性對照組的PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對照組比較無顯著性差異（P>0.05），MNPCE高于溶媒對照組，有顯著性差異（P<0.05），表明試驗系統可靠。35，70，140 mg/kg劑量下，小鼠PCE/（PCE+NCE）比值與溶媒對照組比較，均無顯著性增加（P>0.05），表明對骨髓細胞的造血功能未產生抑制作用。各劑量組MNPCE分別與溶媒對照組比較，均無顯著性差異（P>0.05），表明注射用左旋泮托拉唑鈉在35～140 mg/kg劑量范圍內無誘發小鼠骨髓細胞嗜多染紅細胞微核率增高的作用，小鼠體內微核試驗結果為陰性。結果見表3。

表3 注射用左旋泮托拉唑鈉體內微核試驗結果（ ±s，n＝5）

表3 注射用左旋泮托拉唑鈉體內微核試驗結果（ ±s，n＝5）

注：*P<0.05 vs 溶媒對照組

組別 劑量/mg·kg-1 PCE/（NCE+PCE） MNPCE/%第一次采樣 第二次采樣 第一次采樣 第二次采樣溶媒對照組 / 0.63±0.02 0.62±0.02 0.16±0.05 0.18±0.07陽性對照組 50 0.66±0.03 0.65±0.03 2.56±0.48* 2.43±0.33*注射用左旋泮托拉唑鈉 35 0.62±0.02 0.61±0.02 0.18±0.05 0.16±0.04 70 0.64±0.02 0.63±0.03 0.17±0.04 0.19±0.05 140 0.65±0.04 0.64±0.02 0.18±0.07 0.18±0.06

3 討論

藥物遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內容，目前我國藥物遺傳毒性研究技術指導原則推薦遺傳毒性試驗組合應包含：細菌回復突變試驗，哺乳動物細胞體外試驗（體外中期相染色體畸變試驗或體外微核試驗，或體外小鼠淋巴瘤TK基因突變試驗）和/或體內試驗（微核試驗、骨髓中期相細胞染色體畸變試驗）。因此，本研究采用Ames試驗、CHL細胞體外染色體畸變試驗、小鼠體內微核試驗3項標準試驗組合，體內和體外試驗相結合，對注射用左旋泮托拉唑鈉遺傳毒性進行評價。

本研究的Ames試驗，采用國內評價常用的5種菌株TA98、TA100、TA1535、TA97a和TA102[16-17]，5種菌株均為氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門菌，對菌株進行基因型、回變菌落數鑒定，鑒定合格后用于試驗，根據受試物毒性和評價要求，為充分暴露受試物毒性，采用有一定細菌毒性的劑量作為高劑量，余下以2倍間距設立不同劑量組，同時設立對應的溶媒對照組和陽性對照組，試驗在加S9和不加S9 平行條件下，對受試物有無誘導基因突變的作用進行研究。染色體畸變試驗，指導原則推薦可采用哺乳動物或人的細胞進行試驗。因CHL細胞易在體外建立細胞系，成纖維樣貼壁生長，且自發突變率低，便于染色體分析[18]，被廣泛用于染色體畸變試驗，因此體外染色體畸變試驗采用CHL細胞。試驗前檢查細胞核型及有無支原體污染，在不同代謝活化條件、不同染毒時間下對受試物能否誘導染色體損傷進行了研究，同時設立不同試驗條件下對應的溶媒和陽性對照組。小鼠體內微核試驗選用的昆明小鼠，有較多的背景數據，也是微核試驗常用的的動物種屬[19-20]。根據評價要求，所采用的高劑量組有一定的毒性癥狀，如給藥后步態不穩、自發活動減少、俯臥不動等，研究了受試物不同劑量下對哺乳動物是否有致微核升高的作用。結果表明，在本實驗條件和劑量范圍內，Ames試驗、CHL細胞體外染色體畸變試驗、小鼠體內微核試驗，3項試驗結果均為陰性，未發現注射用左旋泮托拉唑鈉潛在的遺傳毒性作用。