大山楂片薄層色譜鑒別方法的改進

劉立輝，常 華，周艷林，鐘小清，呂高榮，鄒 準，鄒節明

（桂林三金藥業股份有限公司，廣西 桂林 541004）

大山楂片是桂林三金藥業股份有限公司擁有的獨家中成藥品種，其原藥品標準收載于國家藥品標準[1]。本品具有開胃消食的功能，用于食積內停所致的食欲不振，消化不良，脘腹脹悶。處方為山楂540 g、六神曲（麩炒）81 g、炒麥芽81 g。制法為以上三味，取山楂、炒麥芽各72.5 g，粉碎成細粉；其余山楂、炒麥芽和六神曲加水煎煮二次，每次1 h，濾過，濾液濃縮至相對密度1.12 ～ 1.16（60 ℃）的清膏，加入上述細粉及滑石粉17 g、硬脂酸鎂5.7 g，蔗糖粉適量，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成1000片，即得。本品為淡棕色的片，味酸、甜。

近期，本公司在本品種的檢驗中發現按照原藥品標準【鑒別】項下的方法處理，山楂對照藥材溶液難以檢出與熊果酸對照品溶液和大山楂片供試品溶液相應的紫紅色斑點。因此，本研究對山楂對照藥材溶液的制備方法進行了改進，并改進了展開劑、點樣量等色譜條件，最終使山楂對照藥材溶液能清晰地檢測出熊果酸的紫紅色斑點，且斑點顯色清晰，分離度好，陰性樣品無干擾，并使大山楂片供試品溶液的紫紅色斑點的Rf值與山楂對照藥材溶液、熊果酸對照品溶液的紫紅色斑點的Rf值一致，使本品種的藥品標準得到進一步的提高和優化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

REPROSTAR3薄層成像系統（CAMAG公司）；Wincats工作軟件（CAMAG公司）；S7540-12（T）超聲波清洗器[必能信超聲（上海）有限公司]；XP205電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.01 mg）；XP404S電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.1 mg）；P-1型薄層色譜展開缸（上海信誼儀器廠有限公司）；硅膠G薄層預制板（青島海洋化工有限公司，批號：20150129，規格：100 mm×100 mm）；硅膠G薄層預制板（德國默克公司，批號：HX247632，規格：100 mm×100 mm）；硅膠G薄層預制板（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140212，規格：100 mm×100 mm）；YOKO-XR薄層顯色加熱器（武漢藥科新技術開發有限公司）；藥品穩定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）。

1.2 試藥

熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量以99.3 %計，批號：110742-201220）；山楂對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，供薄層鑒別用，批號：121626-201402）；大山楂片（桂林三金藥業股份有限公司，批號：140501，160601，160602，160603）；缺山楂大山楂片陰性樣品（桂林三金藥業股份有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取大山楂片6片，研細，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣用石油醚（30～60 ℃）浸泡2次，每次5 ml（浸泡約0.5 min），傾去石油醚，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為大山楂片供試品溶液。

2.1.2 原標準對照藥材溶液的制備 取山楂對照藥材3 g，加水適量，煎煮約30 min，濾過，濾液加乙醚30 ml提取，分取乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為山楂對照藥材溶液。

2.1.3 改進的對照藥材溶液的制備 取山楂對照藥材1 g，按“2.1.1”項下方法制成山楂對照藥材溶液。

2.1.4 原標準對照品溶液的制備 取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為熊果酸對照品溶液。

2.1.5 改進的對照品溶液的制備 取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 ml含0.4 mg的溶液，作為熊果酸對照品溶液。

2.1.6 陰性樣品溶液的制備 按本品處方和工藝，不加山楂制成缺山楂的大山楂片陰性樣品，按“2.1.1”項下方法制成缺山楂的大山楂片陰性樣品溶液。

2.2 原標準的薄層鑒別方法

按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法[2]，吸取大山楂片供試品溶液與山楂對照藥材溶液各6 μl、熊果酸對照品溶液1 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（13:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點。結果見圖1。由圖1可見，山楂對照藥材溶液在和熊果酸對照品溶液相應的位置上，并沒有顯示相同的紫紅色斑點，且大山楂片供試品溶液的點樣量明顯過載，紫紅色斑點出現嚴重拖尾現象。試驗結果與大山楂片原藥品標準【鑒別】項下描述的“供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點”有差異。

圖1 原標準薄層鑒別方法的色譜圖

2.3 改進的薄層鑒別方法

同法，吸取大山楂片供試品溶液、山楂對照藥材溶液與缺山楂的大山楂片陰性樣品溶液各1～3 μl、熊果酸對照品溶液1 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與山楂對照藥材色譜和熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，且斑點清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無干擾，說明該薄層色譜鑒別方法專屬性強，重復性好。結果見圖2。

圖2 改進的薄層鑒別方法的色譜圖

2.4 改進的薄層鑒別方法的耐用性考察

2.4.1 不同品牌硅膠G薄層預制板的考察 按照改進的薄層鑒別方法，對3個不同品牌的硅膠G薄層預制板（德國默克公司、青島海洋化工有限公司、國藥集團化學試劑有限公司）進行了考察。結果在3個不同品牌的硅膠G薄層預制板上，供試品色譜中，在與山楂對照藥材色譜和熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，且斑點清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無干擾，表明不同品牌的硅膠G薄層預制板對改進的薄層鑒別方法無明顯影響，結果見圖3。

圖3 不同品牌薄層預制板的考察

2.4.2 不同溫度的考察 按照改進的薄層鑒別方法，對低溫（8 ℃）、高溫（35 ℃）進行了考察。結果展開溫度為低溫（8 ℃）、高溫（35 ℃）時，供試品色譜中，在與山楂對照藥材色譜和熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，且斑點清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無干擾，表明不同溫度的展開條件對改進的薄層鑒別方法無明顯影響，結果見圖4。

圖4 不同溫度的考察

2.4.3 不同濕度的考察 按照改進的薄層鑒別方法，對低濕（32 %）、高濕（88 %）進行了考察。結果展開濕度為低濕（32 %）、高濕（88 %）時，供試品色譜中，在與山楂對照藥材色譜和熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，且斑點清晰，分離度好，Rf值一致，而陰性樣品無干擾，表明不同濕度的展開條件對改進的薄層鑒別方法無明顯影響，結果見圖5。

圖5 不同濕度的考察

3 討論

薄層色譜法（TLC）具有成本低、分析時間短、結果直觀性強等優點，目前仍廣泛應用于中藥的定性鑒別分析中。其使用關鍵點在于對樣品的前處理、展開劑、點樣量等的選擇。因此，研究者應根據不同藥品的具體處方適當調整薄層色譜鑒別的條件，以便獲得良好的鑒別分析效果[3-8]。

本研究中，原標準薄層鑒別方法的山楂對照藥材溶液的色譜中，在與熊果酸對照品色譜和大山楂片供試品色譜相應的位置上，并沒有顯相同的紫紅色斑點。而改進的鑒別方法的山楂對照藥材溶液的色譜中，在與熊果酸對照品色譜和大山楂片供試品色譜相應的位置上，卻能顯相同的紫紅色斑點。經分析，系因原標準薄層鑒別方法的山楂對照藥材溶液僅參照了大山楂片的部分制備工藝采用水煎煮處理，未能有效提出脂溶性成分熊果酸所致。而改進后的薄層鑒別方法的山楂對照藥材溶液完全參照大山楂片供試品溶液的制備方法采用乙醚超聲處理，則可以提取并檢測出熊果酸的紫紅色斑點。因此，山楂對照藥材溶液的制備方法應改進為按照大山楂片供試品溶液的制備方法同法制備。

本研究中，按照原標準薄層鑒別方法的色譜條件操作，供試品色譜中熊果酸斑點的Rf值與山楂對照藥材色譜、熊果酸對照品色譜斑點的Rf值不完全一致，主要是因為原標準薄層鑒別方法的展開劑欠佳，以及大山楂片供試品溶液、山楂對照藥材溶液的點樣量和熊果酸對照品溶液的濃度選擇不當，造成點樣量嚴重過載出現拖尾現象。因此，本研究對其色譜條件進行了改進，選擇熊果酸薄層色譜鑒別常用的展開劑：環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）[9]代替原標準采用的展開劑：三氯甲烷-丙酮（13:1），并將大山楂片供試品溶液、山楂對照藥材溶液的點樣量改進為1～3 μl，將熊果酸對照品溶液的濃度改進為每1 ml含0.4 mg，則解決了熊果酸斑點的拖尾現象問題，使供試品色譜中熊果酸斑點的Rf值與山楂對照藥材色譜、熊果酸對照品色譜斑點的Rf值一致。

本研究改進了大山楂片的對照藥材的制備方法，使其與供試品溶液的處理方法一致，可以提取并檢測出熊果酸的紫紅色斑點，并改進了展開劑、點樣量和熊果酸對照品溶液的濃度。改進的大山楂片的薄層色譜鑒別方法比原方法更加科學、合理、完善，并符合質量控制要求，可替代原標準用于大山楂片的薄層色譜鑒別。