黃岡大別山一株野生靈芝的鑒定與馴化栽培*

邢 煒，洪 豆，徐碧林，王 政，劉 暢，范 霞，鄭永良，呂銳玲

（黃岡師范學院 生物與農業資源學院，湖北 黃岡 438000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）隸屬多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬 （Ganodermae）[1]。靈芝是我國傳統名貴中藥，素有“仙草”的美譽。具有免疫調節[2]、抗氧化與延緩衰老[3]、抗糖尿病[4]、延長睡眠時間[5]、神經保護[6]、保護酒精誘導的肝損傷[7]，以及治療癌癥[8]等諸多作用。近年來隨著“健康中國”上升為國家戰略，我國大健康產業蓬勃發展。靈芝作為大健康產業中具有悠久文化歷史的藥用真菌，其相關的基礎研究仍然非常薄弱[9]，其分類的混亂在很大程度上阻礙了靈芝基礎研究的發展。黃岡大別山世界地質公園位于大別山南麓，是中國中央山系地質、地理、生態、氣候分界線的重要組成部分。也是中國重要的生物基因庫，是生物多樣性、豐富性、珍稀性和典型性最具代表的區域之一[10]。

通過對黃岡大別山采集野生靈芝子實體進行形態學及18S rDNA分子鑒定，經馴化后進行小面積制種。在加強野生靈芝資源研究和保護的基礎上，對野生靈芝資源進行馴化和種質資源的開發，培育適合當地氣候的靈芝品種，為靈芝的基礎研究和生產推廣提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1．1．1 供試菌株

從黃岡大別山國家地質公園內蘄春縣株林鎮姑娘山 （東經 115°29′825″，北緯 30°19′521″，海拔52．202 m）采集到野生靈芝子實體，經組織分離獲得菌株HZ1。對照菌株靈芝G10和韓芝購買于華中農業大學菌種中心。

1．1．2 培養基

PDA培養基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 L。土豆煮沸過濾再加入葡萄糖、瓊脂定容至1 L。培養基121℃滅菌30 min，用于原種分離及活化菌株。

PDB培養基：PDA固體培養基不加入瓊脂。主要用于收集菌絲。

原種、栽培種配方為A：櫟木屑80%、麥麩13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；B：桑木屑80%、麥麩13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；C：櫟木屑58%、棉籽殼32%、麩皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、過磷酸鈣0．5%；D：桑木屑58%、棉籽殼32%、麩皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、過磷酸鈣0．5%。水適量（拌好的料中含水量約為60%），pH 5～6，原種培養料用650 mL菌種瓶裝料滅菌，栽培種培養料用聚丙烯塑料袋（33 cm×17 cm×0．005 cm）裝料滅菌。上述培養料均需121℃，滅菌2 h。

1.2 試劑與儀器

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；熊果酸標準品，中國藥檢所；α-淀粉酶（BR級），上海源葉生物科技有限公司；高氯酸、冰醋酸、香草醛、三氯甲烷、苯酚、硼酸銨均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

752C可見紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司；DHZ-C智能恒溫搖床，太倉實驗設備廠；RE-52A旋轉蒸發儀、SHZ-95循環水式多用真空泵，鞏義英峪予華儀器廠。

1.3 試驗方法

1．3．1 形態學鑒定

根據參考文獻[11-12]對野生靈芝子實體形態特征進行鑒定。

1．3．2 菌株分離及保存

采用組織分離法，選取幼嫩未散粉野生靈芝子實體，將菌蓋與菌柄部分用手術刀切成0．5 cm3小塊，經75%酒精消毒10 s，無菌水清洗3遍后，接種于直徑90 mm PDA平板上（25℃，黑暗，3 d），挑取子實體小塊周圍萌發的菌絲，獲得純培養菌株HZ1。將菌株HZ1接種于試管斜面上，待斜面長滿后置于4℃冰箱保存。

1．3．3 菌株HZ1的18S rDNA分子鑒定

采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA，提取的DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行PCR擴增，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。擴增條件為94℃預變性3min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物交由武漢華大基因科技有限公司進行測序，所測得18S rDNA序列與GenBank數據庫進行Blast比對，采用軟件MEGA 7．0對所測18S rDNA序列進行比對、Neighbor Joining法構建系統發育樹。

1．3．4 靈芝菌株HZ1原種培養料的篩選

采用常規制備食用菌栽培種的方法[13]，木屑進行粉碎處理，木屑、棉籽殼、玉米粉和麩皮拌料前提前預濕3 h。已滅菌原種栽培料冷卻至約30℃進行無菌接種，室溫培養，培養期間及時檢查污染狀況和記錄生長情況。培養料配方A、配方B、配方C和配方D各接種30瓶。

1．3．5 靈芝菌株HZ1有效活性成分的測定

將PDA培養基上活化好的菌株（28℃，5 d）沿菌落邊緣用直徑6mm的打孔器打取10個菌餅接入裝有100 mL PDB液體培養基的250 mL的搖瓶中，28℃，100 r·min-1搖床培養7 d，將液體菌絲在無菌條件下勻漿20 s，取4mL菌絲碎片轉接入新的PDB液體培養基，28℃，100 r·min-1搖床培養7 d，用漏斗和濾紙過濾菌絲，烘干至恒重后進行有效活性成分的提取和測定。

1）菌絲體胞內多糖提取

菌絲體胞內多糖提取采取水提法[14]進行。取烘干磨碎的靈芝菌絲體1．0 g，加30倍體積的蒸餾水，于90℃下浸提1．5 h，以轉速10 000 r·min-1離心20 min，取上清液Ⅰ，沉淀加30倍體積的蒸餾水再次浸提 1．5 h，10 000 r·min-1離心 20 min，取上清液Ⅱ，將沉淀烘干；上清液Ⅰ和上清液Ⅱ合并，加入2 mg的α-淀粉酶 60℃酶解1 h，加水定容至100mL，用吸管準確吸取10mL，加入40mL無水乙醇混勻，4℃醇沉12 h，以轉速5 000 r·min-1離心5min，沉淀用80%乙醇潤洗3次，60℃烘干得多糖粗樣品。

2）胞外多糖分離和提取

將菌絲PDB液體培養后過濾所得發酵液100 mL中加入 2 mgα-淀粉酶 60℃酶解1 h）用同樣方法[14]測定胞外多糖含量。

3）靈芝菌絲體蛋白質含量測定

靈芝菌絲體蛋白質含量測定參照參考文獻[15]。

4）靈芝菌絲體總三萜含量的測定

靈芝菌絲體總三萜含量的測定參照參考文獻[16]。

1．3．6 靈芝菌株HZ1農藝性狀的測定

根據1．3．4的栽培配方篩選結果，選擇最適合靈芝菌絲生長的培養料栽培配方裝袋50袋，滅菌接種后置于室溫培養。7 d后測定菌絲生長速度，待子實體成熟后開始測量不同品種靈芝菌蓋的直徑、顏色，菌柄的長度、直徑、顏色等性狀。計算不同品種的鮮品產量。

2 結果與分析

2.1 野生靈芝的形態學鑒定

研究從黃岡大別山國家地質公園蘄春株林鎮姑娘山采集的野生靈芝子實體的生境及其形態特征見圖1。

圖1 野生靈芝生長環境及子實體Fig．1 Fruitbodies and growing environmentof awild Ganoderma lingzhi

由圖1可知，其地面植被為板栗樹、櫟木等闊葉落葉樹種及灌木叢、蕨類等，子實體生長在落葉櫟木伐樁上。靈芝子實體近圓形，菌蓋肥大，輪紋明顯，直徑 5．3 cm～15．6 cm，厚 1．2 cm～1．8 cm；菌柄紅褐色，粗壯有光澤，側生，長度5 cm～15 cm，直徑1．2 cm～2．8 cm，幼芝菌蓋呈扇形，邊緣白色厚實，菌肉白色。根據形態初步鑒定其為多孔菌科靈芝屬真菌。

2.2 野生靈芝的分離

野生靈芝經分離后菌落特征見圖2。

圖2 菌株HZ1菌落形態Fig．2 Colony morphology of strain HZ1

由圖2可知，經分離獲得的野生靈芝菌株HZ1在PDA培養基中菌落圓形，偶爾會出現羽毛狀，菌絲白色，生長到后期菌落中心部位菌絲微發黃，分離獲得的菌株用試管斜面保存于4℃冰箱。

2.3 菌株HZ1 18S rDNA分子鑒定

經PCR擴增和凝膠電泳檢測，獲得18S rDNA序列片段616 bp，測序結果在GenBank中進行Blast比對，構建的分子系統發育樹見圖3。

圖3 靈芝ITS序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogentic tree constructed by Ganodermaspp.based on ITS sequences

由圖3結果表明，菌株HZ1與靈芝屬Ganoderma lingzhi物種聚于系統發育樹的同一支，自展支持率100%。結合形態學鑒定結果，推定菌株HZ1為Ganoderma lingzhi。

2.4 菌株HZ1原種最適培養料配方的篩選

不同原種培養基對菌絲生長發育的影響結果見表1。

表1 不同原種培養基對菌絲生長發育的影響Tab.1 Mycelial growth and development on different mother spawn substrate

從表1可知，菌株HZ1菌絲在原種瓶中萌發和封口時間最早的是配方A和配方B，分別為2 d和5 d；滿瓶時間最早是配方B，其他時間順序依次為配方A（42 d）、配方C（45 d）和配方D（48 d）；配方A菌絲生長濃密、潔白、粗壯，菌絲密度高，生長勢良好。配方B的菌絲滿瓶時間最短，且極少有氣生菌絲，生長勢強，菌絲白色，但菌絲比配方A和配方C稀疏。配方C菌絲濃密、潔白、粗壯，菌絲密度高，生長勢最強。配方D菌絲生長稀疏、發黃，菌絲密度稀薄、不均勻，生長勢較配方A、配方B和配方C差。配方A和配方B有菌皮，配方C和配方D無菌皮。綜合以上特征，菌絲生長最好的是配方C。

2.5 菌株HZ1活性成分含量測定

不同菌株靈芝活性成分含量見表2。

表2 不同靈芝活性成分含量比較Tab.2 Comparison of the active components of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表2可知，菌株HZ1多糖含量0.703mg·mL-1，比對照菌株靈芝G10和韓芝含量高（P<0.01）；菌株靈芝G10蛋白質含量最高（0.085 mg·mL-1），其次為菌株韓芝（0.072 mg·mL-1），菌株HZ1的蛋白質含量達到0.069mg·mL-1，與對照菌株韓芝蛋白質含量差異不顯著。菌株HZ1的總三萜含量0.786mg·mL-1，比對照菌株靈芝G10含量高（P<0.01）。但綜合靈芝多糖、蛋白質和總三萜的總含量，菌株HZ1的總有效活性成分含量高于對照菌株靈芝G10和韓芝。

2.6 菌株HZ1與本地栽培品種農藝性狀的對比試驗

不同靈芝菌株栽培情況統計見表3。

表3 不同靈芝菌株農藝性狀比較Tab.3 Comparison of the agronomic traits of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表3可以看出，菌株HZ1菌絲平均生長速度比對照菌株靈芝G10和韓芝生長速度快（P<0.01），較適宜黃岡本地的氣候條件；菌株HZ1的菌蓋直徑可達20 mm，幼菇顏色淡黃；菌株HZ1的菌柄長度為40 mm，菌柄直徑約17 mm，顏色為紅褐色，每袋可產靈芝鮮菇298 g，比對照菌株靈芝G10和韓芝產量高（P<0.01）。因此，菌株HZ1綜合農藝性狀良好，具有一定的潛在的商業推廣價值。

3 討論與結論

靈芝物種在我國分布廣泛。吳國華等[17]從浙江龍泉森林中獲得了8株野生靈芝菌株，對具有生長優勢的菌株LQ06通過形態學和ITS序列分析，確定為靈芝屬靈芝（Ganoderma lingzhi），并對菌株LQ06進行林下椴木栽培，發現菌株LQ06栽培表現優良。金鑫等[18]分別對采集于海南島的3株野生靈芝進行形態和分子鑒定，并對子實體多糖的單糖組分和抗氧化活性進行了分析，3株靈芝分別為紫芝（G.sinense）、南方靈芝（G.australe）、無柄紫靈芝（G.mastoporum）；3株靈芝多糖的單糖組成和摩爾比存在一定的差異。張焱珍等[19]從云南臨滄的野生靈芝子實體中分離純化獲得純培養物YAASM4672，結合形態學與ITS序列分析鑒定為靈芝（G.lingzhi），并設計了9種栽培種培養基，測定其栽培特性，結果表明該菌在2號栽培種配方（78%玉米芯、18%米糠、2%高粱粉、1%石膏粉、1%白砂糖）中菌絲生長和子實體農藝性狀（覆土組優于露地組）表現最好。趙麗麗等[20]從南平市順昌縣分離獲得一株野生靈芝，經生物學特性比較和ITS測序后鑒定為彎柄靈芝（G.flexipes）。解凡等[21]對采自福建的3株野生靈芝進行鑒定，結果為重傘靈芝（G.multipileum）。

靈芝作為一種藥用真菌，活性成分一直備受關注。李亞晗等[22]報道，靈芝多糖的抗癌作用主要通過免疫調節、抗增殖、促凋亡、抗轉移和抗血管生成。黃晗等[23]報道，靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而減輕膿毒癥大鼠炎癥反應并保護肺功能。亓小妮等[24]報道，靈芝三萜具有抗腫瘤、保肝護肝和增強免疫等生理功能，目前已經成為評價靈芝產品質量的重要指標之一。研究從大別山上分離得到野生靈芝1株，經室內馴化研究發現，活性物質靈芝多糖、蛋白質和總三萜的總含量比對照高，田間的農藝性狀表現也良好，可為靈芝商品化推廣提供菌種資源。