氧化應激在骨關節炎中的研究進展

曹燕，李雪萍

(南京醫科大學附屬南京醫院 南京市第一醫院康復醫學科，南京 210006)

骨關節炎是一種年齡相關的關節退行性疾病，全球范圍內骨關節炎患者已超過3億人[1]。65歲以上人群中骨關節炎的發病率較高，其病理特征包括軟骨損傷、滑膜炎癥、軟骨下骨和關節周圍軟組織的破壞，并伴有關節功能障礙。軟骨損傷是骨關節炎發生發展的主要因素，正常軟骨由大量細胞外基質及少量軟骨細胞構成，軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞類型[2]。骨關節炎是一種多因素疾病，其病因包括遺傳因素、年齡、創傷、糖尿病、肥胖和代謝綜合征[3]。活性氧類(reactive oxygen species，ROS)在軟骨細胞中主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)產生，生理情況下可以調節軟骨細胞凋亡、基因表達及細胞外基質合成和分解，有助于維持軟骨穩態[4]。研究表明，ROS的過量積累可引起氧化應激，進而引起軟骨細胞受損和軟骨基質的降解，促進骨關節炎的發生[5]。現著重闡述氧化應激及其相關信號轉導通路在骨關節炎發病機制中的作用，為骨關節炎靶向治療提供新思路和新方法。

1 氧化應激與ROS

1.2ROS功能 ROS是細胞內信號轉導、基因調節等生理過程中重要的信使分子。有研究表明，ROS可以參與激酶、磷酸酶、半胱氨酸蛋白酶和轉錄因子等生物分子的翻譯后修飾[11]。細胞對ROS的反應方式取決于信號的強度、持續時間以及細胞的氧化還原狀態等。生理條件下在軟骨細胞內主要由NOX產生低濃度ROS，參與細胞內信號調節、維持軟骨代謝[12]。過量ROS可以參與促炎細胞因子對骨關節炎發生發展的驅動過程，導致軟骨細胞凋亡等[13]。ROS還可以通過激活基質金屬蛋白酶破壞軟骨基質中的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，抑制基質合成，導致軟骨完整性的喪失[14]。持續的內源性ROS積累可導致軟骨細胞凋亡、基質降解及氧化還原相關信號轉導通路的破壞，在骨關節炎的發生發展中具有重要作用。

1.3抗氧化系統 細胞內清除ROS、保護細胞免受氧化應激損傷的機制稱為抗氧化系統。抗氧化系統包括SOD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物氧化還原酶等酶促抗氧化劑和非酶抗氧化劑[15]。抗氧化系統可以清除ROS，維持細胞內的氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷。SOD2是一種能夠代謝ROS的線粒體酶，軟骨細胞中SOD2缺乏可導致細胞內ROS過度積聚，引起氧化損傷[16]。CAT是關鍵的抗氧化酶之一，通過破壞細胞中的H2O2產生水和氧氣，在很大程度上減輕ROS過度產生引起的氧化應激作用。CAT的缺乏或功能障礙被認為與骨關節炎等衰老相關疾病的發生有關[17]。過氧化物氧化還原酶是主要負責還原H2O2的抗氧化蛋白家族，可以保護軟骨免受氧化損傷，在軟骨中發揮重要的氧化還原平衡作用[18]。

1.4氧化應激 當細胞內ROS的產生超過抗氧化系統對ROS的清除能力時，過量的ROS導致細胞和組織的氧化損傷，稱為氧化應激[19]。在細胞水平上，氧化應激導致線粒體DNA和核DNA損傷、脂質過氧化、蛋白質羰基化、端粒縮短以及細胞信號和代謝途徑的改變。研究發現，骨關節炎患者軟骨細胞中總過氧化物濃度和氧化應激水平升高[20]。除了ROS產生增加外，骨關節炎軟骨細胞中抗氧化酶水平下降也可引起氧化應激。Zhuang等[21]研究發現，骨關節炎軟骨細胞中SOD、CAT等抗氧化酶水平顯著低于正常軟骨細胞，表明抗氧化能力不足可能引起軟骨損傷，氧化應激在骨關節炎發病機制中起重要作用。

2 氧化應激與骨關節炎的發病機制

氧化應激是骨關節炎發生發展的主要因素之一。在軟骨細胞中，氧化應激通過促進細胞凋亡、誘導細胞自噬失衡等機制參與骨關節炎的發病。

2.1氧化應激與軟骨細胞凋亡 軟骨細胞缺乏自我更新能力，軟骨細胞凋亡在骨關節炎發病機制中起重要作用[22]。細胞凋亡是氧化應激期間的主要病理改變之一，ROS可以通過誘導軟骨細胞凋亡促進骨關節炎的發生發展。Pan等[23]將暴露于H2O2的軟骨細胞用作實驗性氧化應激模型，通過磷脂酰絲氨酸-碘化丙啶雙染色法發現H2O2可以促進軟骨細胞凋亡，應用抗氧化劑可以降低細胞內丙二醛水平、增加SOD表達，且抑制軟骨細胞內聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、胱天蛋白酶(caspase)等凋亡相關蛋白的表達，表明抑制氧化應激可以減少H2O2誘導的軟骨細胞凋亡。Li等[24]研究通過評估H2O2誘導的軟骨細胞內ROS水平、誘導型一氧化氮合酶的表達以及軟骨細胞內磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶、caspase-9和caspase-3的表達發現，氧化應激可以通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和caspase途徑導致軟骨細胞凋亡。骨氧還蛋白1是一種巰基二硫鍵氧化還原酶，可以參與抗氧化、抗凋亡等細胞過程。Sun等[25]研究發現骨氧還蛋白1表達上調可以通過增加環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，經血紅素加氧酶1途徑限制骨關節炎軟骨細胞的氧化應激，減少軟骨細胞凋亡，為骨關節炎的治療提供了新方向。

2.2氧化應激與軟骨細胞自噬 自噬是一種重要的細胞穩態機制，用于清除細胞內失活的細胞器和大分子，與程序性細胞死亡、氧化應激等生物學過程相關[26]。Goutas等[27]的研究揭示了健康人和骨關節炎患者的軟骨細胞對急性氧化損傷的自噬反應的差異，表明氧化應激相關的軟骨細胞自噬反應在骨關節炎中具有重要作用。該研究還發現，暴露于氧化應激后，正常軟骨細胞中自噬相關基因的信使RNA和蛋白質表達水平最初增加，6～24 h后降至基礎水平；而在骨關節炎軟骨細胞中，自噬基因的表達即使在24 h后仍保持較高水平，表明其調節自噬的能力減弱。提示氧化應激可能通過引起軟骨細胞自噬缺陷導致骨關節炎發生。Tang等[28]使用叔丁基過氧化氫誘導的小鼠軟骨細胞和實施內側半月板失穩術的小鼠作為骨關節炎模型，分別在體內和體外研究自噬誘導劑海藻糖對氧化應激下骨關節炎軟骨細胞及軟骨的作用。結果發現，海藻糖可以改善氧化應激導致的線粒體膜電位塌陷、ATP水平降低和DNA損傷，自噬抑制劑可以抵消海藻糖對氧化應激誘導的軟骨細胞的保護作用。以上結果表明誘導軟骨細胞自噬可為骨關節炎的治療提供新方向。

2.3氧化應激與微RNA(microRNA，miRNA/miR) miRNA是進化上保守的短鏈非編碼RNA亞家族，其序列長度約為22個核苷酸。miRNA可以作為有效的轉錄后調節因子，是調節疾病和衰老過程中分子機制的潛在靶標[29]。一項對老年人和骨關節炎患者軟骨進行的微陣列研究結果顯示，多種miRNA在衰老軟骨和骨關節炎軟骨中的表達水平發生改變[30]。Zou等[31]在體外用IL-1β誘導小鼠軟骨細胞，模擬骨關節炎時的病理環境，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應和Western blotting法檢測miR-375和Janus激酶2-信號轉導及轉錄激活因子3通路的表達，結果顯示與對照組相比，IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-375顯著增加，細胞增殖和SOD水平降低，而軟骨降解酶表達上調，細胞外基質成分合成減少。Cheleschi等[32]用miR-34a、miR-181a抑制劑轉染氧化應激誘導的骨關節炎軟骨細胞，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miRNA、抗氧化酶的表達，結果發現氧化應激誘導的軟骨細胞中miR-34a、miR-181a、SOD2和CAT表達增加，抑制miR-34a、miR-181a可以減輕骨關節炎軟骨細胞凋亡和氧化損傷。董寶鐵等[33]研究發現miR-1286a在骨關節炎軟骨組織及碘乙酸誘導的骨關節炎軟骨細胞中表達顯著升高，抑制miR-1286a可以減輕骨關節炎軟骨細胞凋亡和氧化應激損傷。以上研究結果表明，部分miRNA可能通過氧化應激途徑參與骨關節炎的發生，近年來miRNA已用于監測骨關節炎的進展，并作為評估軟骨修復的工具。

3 氧化應激相關信號轉導通路與骨關節炎

氧化應激導致骨關節炎的發病機制與多種氧化還原相關信號轉導通路的調節有關，其中涉及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路、核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路、沉默信息調節因子2同源蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)通路以及叉頭框轉錄因子O(forkhead box O，FoxO)信號通路。

3.1NF-κB通路與骨關節炎 NF-κB是一種廣泛存在于真核生物細胞中的轉錄激活因子，可以調節與免疫、炎癥、應激反應相關的多種基因，在機體的病理生理反應中發揮重要功能[34]。在軟骨細胞中，NF-κB是多種炎癥因子在細胞內信號轉導的共同途徑，作為氧化應激的傳感器，可以導致軟骨代謝異常，促進骨關節炎進展[35]。有研究發現，川芎嗪、白藜蘆醇等可以通過抑制NF-κB通路減輕IL-1β誘導的軟骨細胞氧化應激和炎癥反應，延緩骨關節炎的進展[36-37]。Hu等[38]研究表明，沙克列汀可以通過下調NF-κB通路減少骨關節炎軟骨細胞中ROS的產生和增加谷胱甘肽的表達，并且降低基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-13以及解聚蛋白樣金屬蛋白酶的表達，進而減少氧化應激引起的軟骨細胞凋亡和基質降解。以上研究表明，NF-κB通路的調控可能成為骨關節炎治療的新方法。

3.2Nrf2通路與骨關節炎 Nrf2是調控細胞內氧化還原反應和信號轉導的關鍵轉錄因子，在減少細胞內氧化應激損傷、延緩細胞衰老和預防衰老相關疾病等方面發揮重要作用[39]。Nrf2能夠調節參與應激反應的基因表達水平，并且參與CAT、SOD等抗氧化酶的合成[40]。Khan等[41]研究發現，與正常軟骨相比，骨關節炎軟骨中Nrf2及其靶基因的表達顯著升高。Nrf2過表達可以激活胞外信號調節激酶1/2信號及其下游靶標，顯著抑制IL-1β誘導的軟骨細胞中ROS的生成，減輕線粒體功能障礙和軟骨細胞凋亡，表明Nrf2激活在骨關節炎中具有抗氧化和抗凋亡功能，并可以通過激活胞外信號調節激酶1/2信號起作用。宋永周等[42]研究發現姜黃素可以通過增強Nrf2表達而降低H2O2誘導的軟骨細胞的氧化應激水平。Gao等[43]研究發現鋅指家族成員Kruppel樣因子2可以通過增強Nrf2的核易位，導致其下游的靶分子血紅素加氧酶-1和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化還原酶1的表達增加，進而抑制ROS的產生以減輕IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和基質降解。總之，Nrf2通路激活可以降低軟骨細胞內ROS的水平，抑制氧化應激過程，從而保護軟骨細胞免于氧化應激損傷。

3.3SIRT1途徑與骨關節炎 SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，具有調節機體代謝、修復DNA損傷、抵抗應激反應、延緩衰老等作用。SIRT1在骨關節炎中具有抗炎、抗氧化應激和抗凋亡作用，并且可以調節骨穩態、抑制骨關節炎的進展[44]。Feng等[45]用叔丁基過氧化氫刺激的大鼠軟骨細胞作為骨關節炎體外模型來研究槲皮素的作用，結果表明槲皮素可以通過激活SIRT1/AMP活化的蛋白激酶信號轉導通路減輕氧化應激、內質網應激和軟骨細胞凋亡，在動物模型中也證實了其對骨關節炎軟骨的保護作用。Feng等[46]進一步研究發現姜黃素通過促進氧化應激誘導的大鼠軟骨細胞中SIRT1表達，降低軟骨細胞中C/EBP同源蛋白水平并上調軟骨保護蛋白Bcl-2的表達，從而抑制氧化應激引起的軟骨細胞凋亡，延緩骨關節炎進展。SIRT1是目前研究最充分的沉默信息調節蛋白之一，該家族其他成員是否也有類似作用還需要更多的研究進行證實。綜上所述，SIRT1有望成為治療骨關節炎的重要靶點。

3.4FoxO轉錄因子與骨關節炎 FoxO家族是一類調節炎癥、自噬、衰老等過程的轉錄因子，其活性與磷酸化狀態直接相關。有研究表明FoxO轉錄因子可以調節軟骨細胞的生長、成熟和基質合成，并通過調節氧化應激反應對軟骨細胞發揮保護作用[47]。Akasaki等[48]研究發現，FoxO轉錄因子在老年人和骨關節炎患者的軟骨中表達下降且發生磷酸化改變，提示FoxO表達變化可能與軟骨退變相關。Akasaki等[49]進一步研究了下調的FoxO轉錄因子對骨關節炎軟骨細胞的影響，用叔丁基過氧化氫處理人關節軟骨細胞，并將靶向FoxO1和FoxO3的小干擾RNA轉染入軟骨細胞中沉默FoxO1和FoxO3的表達，通過噻唑藍比色法測定細胞活力，檢測軟骨細胞中凋亡相關的caspase蛋白表達，并評估了CAT等抗氧化酶和SIRT1蛋白表達。結果發現轉染后的軟骨細胞中凋亡明顯增加、細胞活力下降，抗氧化酶和SIRT1水平明顯降低。上述結果表明，FoxO轉錄因子在骨關節炎軟骨細胞中具有抗氧化應激、抗凋亡的作用，可為骨關節炎的治療提供新靶點。

4 小 結

骨關節炎的發生發展受到多種因素的調控，氧化應激在骨關節炎的進展中起重要作用，可通過多種機制促進骨關節炎進展。軟骨細胞內ROS過度產生及內源性抗氧化能力不足可引起氧化應激，進一步導致軟骨細胞凋亡和軟骨基質降解，破壞軟骨結構完整性，加重軟骨損傷。研究發現NF-κB、Nrf2及SIRT1等氧化應激相關的信號轉導通路參與骨關節炎的發生發展。氧化應激影響軟骨代謝的機制非常復雜，目前對維持軟骨細胞的氧化還原穩態的機制及相關通路仍不明確，需要進一步研究闡明氧化應激與骨關節炎的關系，從多角度深入揭示氧化應激導致骨關節炎的具體機制，為臨床上骨關節炎的治療提供新思路。