多色流式細(xì)胞術(shù)檢測HIV/AIDS患者CD4+ T細(xì)胞亞群變化

王芯櫟，汪 笛，魏雨晴，張瓃丹，李 蓓，杜 娟，趙紅心，孔雅嫻

AIDS是由HIV感染引起的一種病死率極高的惡性傳染病。CD4+T細(xì)胞是HIV攻擊的主要靶細(xì)胞[1-2]，其數(shù)量減少和功能下降是導(dǎo)致HIV/AIDS患者免疫應(yīng)答水平低下、各種機(jī)會(huì)性感染高發(fā)的主要原因。初始的CD4+T細(xì)胞活化后分化成不同的輔助性T細(xì)胞（helper T cells, Th）亞群，包括 Th1、Th2、Th9、Th17、濾泡輔助性 T細(xì)胞（T follicular helper cell, Tfh）等。Th的分化過程受T細(xì)胞受體信號、特異的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控，并產(chǎn)生譜系特異性的細(xì)胞因子[3]。Th1分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12，并特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-13，并選擇性地依賴于GATA3的表達(dá)；Th17在轉(zhuǎn)錄因子RORγt的調(diào)節(jié)下特異性地產(chǎn)生IL-17；Th22的特征是分泌IL-22及表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子AHR；Th9是Th的一個(gè)新亞群，它分泌IL-9和IL-10并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子PU.1[3-5]。Th不僅通過分泌細(xì)胞因子引起慢性炎癥來參與HIV的感染進(jìn)程，還是HIV復(fù)制的場所[1，7]。因此，檢測Th亞群的數(shù)量與比例，對于研究HIV/AIDS患者的免疫狀態(tài)與預(yù)后判斷至關(guān)重要。

既往研究通過檢測細(xì)胞因子來確定Th亞群的數(shù)量和比例。最初利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法或原位雜交等方法，只能確定單一細(xì)胞因子，也不能準(zhǔn)確地確定細(xì)胞類型[8-9]。隨著多色流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，后續(xù)研究能在單細(xì)胞水平檢測多種細(xì)胞因子指標(biāo)，彌補(bǔ)了檢測單一細(xì)胞因子的不足。然而，多色流式檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)過程和分析方法復(fù)雜[10-11]，并且細(xì)胞在體外被長時(shí)間刺激后已不能反映體內(nèi)的真實(shí)情況。

不同的Th亞群除了產(chǎn)生的細(xì)胞因子具有譜系特異性，其遷移能力也具有高度保守的專一性，因此才能介導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。趨化因子受體分子表達(dá)水平的異質(zhì)性是協(xié)調(diào)Th遷移、定位到適當(dāng)位置的分子基礎(chǔ)。Th1表達(dá)的趨化因子受體包括CXCR3和CCR5，這些分子有利于Th1向感染或炎癥部位遷移和與抗原提呈細(xì)胞相互作用；Th2則表達(dá)CCR3、CCR4和CCR8等趨化因子受體；Th17表面的CCR6與細(xì)胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)[12-14]。細(xì)胞表面特異的分子表達(dá)不僅起著協(xié)調(diào)Th發(fā)揮免疫功能的作用，也是替代細(xì)胞因子識別Th的關(guān)鍵分子。因此，使用表面趨化因子受體識別Th更有利于研究其在體內(nèi)的真實(shí)數(shù)量和比例。近年來，有研究使用不同趨化因子受體組合來區(qū)分Th亞群，比如：Th1（CXCR3+）、Th2（CCR10-CCR4+CCR6-）、Th9（CCR4-CCR6+）等；但僅局限于1種或少數(shù)幾種Th，并沒有同時(shí)檢測多個(gè)亞群[15-21]。綜上，本研究建立了十一色流式方案，通過11種表面標(biāo)志物的不同組合對Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh、ThG亞群進(jìn)行檢測分析。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019年9月24日—12月18日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院皮膚科門診就診的未治療HIV/AIDS患者15例和性別、年齡匹配的健康對照15例作為研究對象。15例患者皆為男性，年齡19～56歲，平均（31.4±10.89）歲；CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)處于43～742個(gè)/μl之間，HIV載量在2.2～5.5 lg copies/ml之間。納入標(biāo)準(zhǔn)為：①年齡18～65周歲；②ELISA檢測HIV-1抗體陽性并通過Western Blot法確認(rèn)；③在北京地壇醫(yī)院初始治療并未服用抗病毒藥物者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并HBV/HCV感染者；②合并梅毒螺旋體感染者；④留取血液標(biāo)本時(shí)有現(xiàn)癥機(jī)會(huì)性感染或AIDS相關(guān)惡性腫瘤者；⑤妊娠期、哺乳期的婦女。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 抗體（美國BD Biosciences公司，美國BioLegend 公司）、7-AAD染料（美國BD Biosciences公司）、淋巴細(xì)胞分離液（德國Stemcell Technologies公司）、流式細(xì)胞儀Fortessa（美國BD Biosciences公司）、含EDTA-K2的真空采血管（奧地利Greiner Bio-One公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的分離 通過密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。在15 ml離心管中加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液，隨后將8 ml全血輕輕鋪在淋巴細(xì)胞分離液上；2000 r/min，20 min離心；吸取血漿層和分層液界面之間的白膜狀單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸和洗滌；1500 r/min，10 min離心，棄去上清，加入10 ml 1640培養(yǎng)液再次重懸洗滌細(xì)胞，1200 r/min，5 min離心；用1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至 1×107個(gè)細(xì)胞 /ml，取 1×106個(gè)細(xì)胞 /管至流式管中染色。

1.3.2 抗體的選擇和表面標(biāo)志物的染色 根據(jù)多色流式細(xì)胞術(shù)檢測配色原則：弱表達(dá)的抗原搭配強(qiáng)熒光抗體，高表達(dá)的抗原選擇較低強(qiáng)度熒光抗體。選擇CD3-BV786、CD4-APC- fire750、CD8-BV510、CD45RA-BV711、CCR7-BV421、CXCR5-FITC、CXCR3-APC、CCR10-PE、CCR6-PE-CF594、CCR4-PE-Cy7，室溫避光染色30 min后，PBS洗滌；加入3 μl 7-AAD染色3 min，區(qū)分細(xì)胞的生存狀態(tài)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血中Th的比例 用流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa）檢測，在淋巴細(xì)胞中以FSC-A和FSC-H設(shè)門，去除粘連的細(xì)胞。根據(jù)前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）圈出淋巴細(xì)胞，而后使用7-AAD表達(dá)圈出活的CD3+T細(xì)胞，再進(jìn)一步圈出CD4+T細(xì)胞（圖1A）。確定CD4亞群后，根據(jù)各亞群趨化因子搭配圈出Th，采用Flowjo軟件進(jìn)行多色分析，并計(jì)算各Th亞群比例。

圖1 HIV/AIDS患者外周血中Th的分析策略A.用SSC和FSC圈出淋巴細(xì)胞后，通過CD3和CD4圈出CD4+ T細(xì)胞；B.選擇CD45RA陰性細(xì)胞，根據(jù)CXCR5圈出陽性的Tfh，在CXCR5-群中根據(jù)CCR6和CCR4將細(xì)胞分為4個(gè)亞群；C.根據(jù)CXCR3和CCR10圈出其他6種ThFigure 1 Analysis strategies of Th in peripheral blood from HIV/AIDS patients

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPadPrism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析制圖。計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，即M（Q1, Q3），通過Kolmogorov-Smirnov test檢測數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)分布，若符合正態(tài)分布，組間比較采用非配對t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基于表面標(biāo)志物的人外周血Th分析策略 利用建立的多色流式細(xì)胞術(shù)檢測方案檢測HIV/AIDS患者外周血標(biāo)本，其設(shè)門策略在圈出CD4+T細(xì)胞以后主要分成三步。首先，排除CD45RA陽性的細(xì)胞群（初始CD4+T細(xì)胞），在CD45RA陰性細(xì)胞群（記憶CD4+T細(xì)胞）里，根據(jù)CXCR5和CCR10設(shè)門圈出CXCR5+CCR10-的Tfh，這些細(xì)胞特異性表達(dá)CXCR5，使生發(fā)中心的濾泡狀樹突狀細(xì)胞歸巢，輔助漿細(xì)胞的成熟。第二步是在CXCR5陰性細(xì)胞群里根據(jù)CCR4和CCR6設(shè)門，將細(xì)胞分成4群，即CCR4+CCR6-、CCR4+CCR6+、CCR4-CCR6+和 CCR4-CCR6-（圖1B）。最后，根據(jù)CXCR3和CCR10的表達(dá)確定Tfh以外的6種Th，分別是ThG（CXCR5-CCR4+CCR6-CCR10+CXCR3-）、Th2（CXCR5-CCR4+CCR6-CCR10-CXCR3-）、Th22（CXCR5-CCR4+CCR6+CCR10+CXCR3-）、Th17（ CXCR5-CCR4+CCR6+CCR10-CXCR3-）、Th9（CXCR5-CCR4-CCR6+CCR10-CXCR3-） 和 Th1（CXCR5-CCR4-CCR6-CCR10-CXCR3+）（圖1C），并計(jì)算各亞群的比例。

2.2 HIV/AIDS患者和健康對照中Th的比例情況 基于上述檢測，15例HIV/AIDS患者和15例健康對照外周血中7種Th和初始CD4+T細(xì)胞的比例情況見表1。在HIV/AIDS患者中比例增加的Th包括Th1、Th2、Tfh、ThG。其中Th2在HIV/AIDS患者中的比例為6.0（4.8，10.6）%顯著高于健康對照組4.3（3.2，6.3）%，（P=0.029）；健康對照的Tfh比例為10.1（9.3，11.1）%，而HIV/AIDS患者的Tfh比例為11.6（8.8，15.5）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.052）。Th1、ThG比例在2組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。Th9、Th17以及Th22的比例在HIV/AIDS患者中均低于健康對照，其中Th22比例下降最為顯著（P=0.032）。

表1 HIV/AIDS患者和健康對照者外周血中Th的比例情況（%）Table 1 Comparisons of Th proportion in peripheral blood between HIV/AIDS patients and healthy controls(%)

3 討 論

初始CD4+T細(xì)胞活化后分化為多個(gè)Th亞群，并且分泌譜系特異性細(xì)胞因子。不同Th亞群通過這些特異性的細(xì)胞因子，參與多種感染的免疫應(yīng)答，以及過敏、哮喘等多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制[18]。Th作為HIV靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的主要亞群，其數(shù)量與功能的改變嚴(yán)重影響AIDS的疾病進(jìn)展。因此，建立與優(yōu)化 Th亞群的檢測方法對于深入研究HIV/AIDS患者的免疫狀態(tài)與預(yù)后判斷至關(guān)重要。

根據(jù)Th亞群分泌的特異性細(xì)胞因子確定Th的亞型，是既往研究中經(jīng)常用到的實(shí)驗(yàn)方法[11，19-20]。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法和流式細(xì)胞術(shù)是最典型的2種方法，它們通過對胞漿內(nèi)細(xì)胞因子的染色，在單細(xì)胞水平上檢測Th。2者相比，流式細(xì)胞術(shù)不僅能同時(shí)檢測多種細(xì)胞因子，而且可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和表面標(biāo)志物，較為準(zhǔn)確地確定Th亞群的數(shù)量和比例。此外，根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱還可以判斷細(xì)胞因子的分泌情況，從側(cè)面分析細(xì)胞的功能。然而檢測細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法都基于在體外對細(xì)胞的額外刺激，不僅實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、不易控制變量，且不能客觀地反映Th在體內(nèi)真實(shí)的數(shù)量和比例。Th的異質(zhì)性一方面源于分泌的細(xì)胞因子的特異性，另一方面是歸巢受體（選擇素、整合素、趨化因子受體）的表達(dá)水平，這些受體不同的組合方式便決定了不同類型的Th歸巢到不同組織的能力[21]。因此，使用趨化因子受體作為替代細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的工具將有助于Th的識別和檢測。目前基于趨化因子區(qū)分Th亞群方式還沒有明確的定義，有文獻(xiàn)報(bào)道稱Th1表型為CCR4-CCR6-CCR10-CXCR3+，Th2 為 CCR4+CCR6-CXCR3-，Th17為CCR4+CCR6+CCR10-CXCR3-；其他的研究則認(rèn)為Th1為CXCR3+，Th2為CCR10-CCR4+CCR6-，Th17 為 CCR10-CCR4+CCR6+[17，22]。目前文獻(xiàn)里報(bào)道的趨化因子的分析策略紛繁復(fù)雜，不同的策略各有重點(diǎn)，大多數(shù)的研究偏向于分析某一種或少數(shù)幾種的Th。這些因素都導(dǎo)致了研究者不能很好地分析目前大部分的Th在體內(nèi)的數(shù)量和比例。故本研究建立了十一色流式染色策略，能夠同時(shí)對7種Th進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)步驟簡單快捷，且對細(xì)胞的人為傷害相對較小，能夠較為真實(shí)地反映細(xì)胞的體內(nèi)狀態(tài)，有利于純化細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)安排。

基于上述的染色方案，本研究檢測了15例HIV/AIDS患者和15例健康對照外周血中Th的比例，并且對比分析2組之間的差異。研究發(fā)現(xiàn)，Th2和Tfh數(shù)量在HIV/AIDS患者體內(nèi)均有不同程度的增加。既往文獻(xiàn)表明HIV/AIDS患者的CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-2和IFN-γ的細(xì)胞百分比降低，同時(shí)產(chǎn)生IL-4和IL-10的細(xì)胞比例增加[23]。在本研究中，HIV/AIDS患者體內(nèi)Th2比例確實(shí)高于健康對照，但是并沒有觀察到Th1數(shù)量的顯著變化，推測可能與樣本量小和患者都處于感染早期有關(guān)。本研究中觀察到的Tfh變化趨勢與既往文獻(xiàn)報(bào)道是一致的，在機(jī)體受到HIV攻擊以后，Tfh的數(shù)量不減反增，其作為HIV增殖的場所，為HIV的長期潛伏創(chuàng)造了一個(gè)良好的環(huán)境[24]。

Th具有各自的特點(diǎn)，它們在HIV感染過程中的變化也不相同。本研究發(fā)現(xiàn)Th22的比例在HIV/AIDS患者體內(nèi)顯著降低。既往研究表明Th22的比例變化與全身的炎癥狀態(tài)和黏膜免疫能力密切相關(guān)，如牛皮癬和哮喘等[23，25-27]。Th22數(shù)量和比例的減少能夠在一定程度上促進(jìn)HIV引起的慢性感染，使得疾病進(jìn)一步地惡化[28-29]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道了Th17數(shù)量在HIV感染進(jìn)程中會(huì)減少，降低機(jī)體對HIV感染的抵御能力[30]；Th9分泌的IL-9在HIV急性感染與慢性感染中濃度不同[29]。但是在本研究中，并沒有觀察到Th17和Th9以及ThG比例在2組之間的差異。推測這與樣本量小，并且與患者感染時(shí)間短、病程都處于初級階段有關(guān)，有待在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和在不同疾病進(jìn)程的患者體內(nèi)檢測Th的數(shù)量和比例。

總之，Th及其分泌的細(xì)胞因子在HIV感染中發(fā)揮的作用不盡相同。本研究設(shè)計(jì)的十一色流式染色策略使得分析Th的亞群更加方便和快捷。全面且詳實(shí)地了解Th在HIV感染過程中的變化有利于研究HIV/AIDS患者的免疫狀態(tài)和判斷預(yù)后。