99mTc- 3PRGD 2SPECT顯像在大鼠乳腺癌新輔助化療中的療效評估△

楊鵬杰，楊昊，何鑫，郭艷，王榮花，徐宏魁，武瑜#

內蒙古自治區腫瘤醫院（內蒙古醫科大學附屬人民醫院）1胸外科，2放療科，3核醫學科，4乳腺腫瘤科，呼和浩特 010010

新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在局部晚期乳腺癌治療中，具有縮瘤降期、改善遠期預后等優勢。循證醫學證據顯示，如果乳腺癌NAC可以達到病理完全緩解（pathologiccomplete response，PCR），那么其生存率將會明顯提高。因此，如何有效且準確評價NAC療效是評估最佳手術時機和調整化療方案的重要前提。目前臨床上評價NAC療效主要是通過臨床查體或超聲、MRI等影像學檢查手段，但公認的金標準仍然是病理檢查，由于病理檢查的有創性和療效評估的滯后性等，臨床上并未廣泛采用，因此找到一個無創且靈敏度和特異度較高的評價手段顯得尤為重要。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的多肽（Arg-Gly-Asp，RGD）與細胞整合素αβ是天然的受體配體，在腫瘤新生血管形成中起到了重要作用。Tc-RGD已被用于腫瘤新生血管的檢測，Tc-3PRGD是新型的Tc標記RGD顯像劑，已被證實其靈敏度和特異度均較高。本研究旨在通過Tc-3PRGD單光子發射計算機斷層掃描（single-photon emission computed tomography，SPECT）顯像，探討其對大鼠乳腺癌模型NAC效果的評估價值，為臨床準確評價NAC療效、調整化療方案及決定最佳手術時機提供實驗數據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和藥品

SPECT，熒光顯微鏡，小動物體表超聲診斷儀，Tc-3PRGD，表柔比星，多西他賽，環磷酰胺等。

1.2 實驗動物及乳腺癌大鼠模型建立

選取體重190～210 g雌性SD大鼠53只，生產許可證號為SCXK（京）2012-0001。常規進行Walker-256腫瘤細胞培養，培養環境為含10%小牛血清1640培養液在37℃、5% CO濃度培養箱，當細胞培養達到80%～90%時，取細胞懸液進行種鼠腹腔內注射（細胞數約1.0×10/ml），1周后可形成腹腔積液瘤。抽取并調節腹腔積液腫瘤懸液細胞濃度至4.0×10/ml。使用10%水合氯醛進行大鼠腹腔麻醉，于左側腋窩皮下進行腫瘤接種。53只雌性SD大鼠中48只為實驗組，皮下緩存注射Walker-256腫瘤細胞懸液0.8 ml左腋窩注射；5只為空白對照組，給予生理鹽水0.8 ml左腋窩注射。待大鼠腫瘤最大直徑達到1.0 cm時行SPECT、彩色多普勒超聲及細針穿刺活細胞檢查。

1.3 實驗方法

乳腺癌大鼠造模成功后，NAC前行細針穿刺活檢，NAC后取下組織標本，行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosi，HE）染色，觀察新生血管情況及腫瘤在治療前后退縮情況。當乳腺癌模型大鼠查體及超聲檢查示腫瘤體積達到1 cm時開始治療，每周給藥1次，共4次，根據目前乳腺癌常用化療方案（蒽環類聯合紫杉類化療方案）進行，其中表柔比星12.36 mg/kg，多西他賽9.27 mg/kg，環磷酰胺61.80 mg/kg，于大鼠尾靜脈注射，治療結束后1周處死所有大鼠。

1.4 觀察指標及評價標準

定量分析乳腺癌模型大鼠NAC前后Tc-3PRGDSPECT顯像各項技術指標（T/NT、T/NT），分析NAC前后乳腺癌模型大鼠彩色多普勒超聲檢查各項技術指標（腫塊的形態、與周圍組織是否存在明顯邊界、是否含有包膜、腫瘤周邊、內部、后方回聲情況及彩色多普勒超聲觀察血流顯像并進行血流信號分級），以病理學診斷為金標準，評價Tc-3PRGDSPECT顯像及彩色多普勒超聲檢查對NAC療效的診斷效能。①以NAC前測得的腫瘤最大直徑為基線，根據實體瘤療效評價標準1.1版（response evaluation criteria in solid tumor version 1.1，RECIST 1.1）評估 NAC 的療效，完全緩解（complete response，CR）：全部腫瘤消失；部分緩解（partial response，PR）：腫瘤最大直徑與基線相比縮小≥30%；病情穩定（stable disease，SD）：腫瘤最大直徑與基線相比縮小＜30%或增加＜20%；疾病進展（progressive disease，PD）：腫瘤最大直徑與基線相比增加≥20%。②病理評價標準：根據Miller and Payne病理反應分級標準將NAC前活檢病理切片和NAC后病理切片進行比較，根據腫瘤細胞消退狀況分為5級，1級為局部腫瘤細胞出現變化，但總體數目未變；2級為腫瘤細胞數目減少＜30%；3級為腫瘤細胞數目減少30%～90%；4級為腫瘤細胞數目減少＞90%；5級為無浸潤性腫瘤成分。其中將1級與2級定義為無效，3～5級為有效。③彩色多普勒超聲血流信號分級：依照Adler分級標準，將腫瘤的血流信號分為0～Ⅲ4個等級，0級表現為病灶內未見血流；Ⅰ級表現為少量血流，可見1～2處點狀血流或棒狀血流信號；Ⅱ級表現為中量血流，可見3～4處點狀血流信號或1條長度超過或接近腫塊半徑的血管；Ⅲ級表現為豐富血流，可見≥3條血管或血管相互連通，交織成網狀。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 實驗組大鼠一般情況

2周后，實驗組48只大鼠中40只腫瘤造模成功，成瘤率83.33%（40/53），5只未見腫瘤成團、左腋窩無明顯腫物，死亡3只。NAC后，40只造模成功大鼠中死亡4只，2只為CR，33只為PR，1只為SD，未見PD大鼠。實驗組大鼠NAC后腫瘤最大直徑為（0.52±0.06）cm，明顯小于NAC前的（1.13±0.18）cm，差異有統計學意義（

P

＜0.01）。

2.2 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT顯像情況

實驗組大鼠NAC前后左側腋窩部位T/NT值、T/NT值均高于空白對照組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。實驗組大鼠NAC后左側腋窩部位T/NT值、T/NT值均低于NAC前，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）（表1）。空白對照大鼠全身顯像劑分布正常，左側腋窩部位注射生理鹽水后未見異常顯像劑攝取增高（圖1A）；實驗大鼠給予左側腋窩接種腫瘤細胞造模成功后可見顯像劑異常攝取（圖1B）；實驗組造模成功大鼠NAC治療后可見顯像劑攝取明顯下降（圖1C）。

表1 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT的顯像情況（±s）

圖1 空白對照及實驗大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT顯像圖

2.3 大鼠彩色多普勒超聲檢查情況

彩色多普勒超聲檢查結果顯示，實驗組大鼠造模成功后表現為腫瘤呈不規則團塊，邊界不清楚，形態不規則，內可見回聲不均勻，部分腫塊周邊可見強回聲帶，內部回聲偏低、不均勻，有點簇狀強回聲鈣化灶。彩色多普勒血流顯像（color doppler flow imaging，CDFI）顯示，腫物周邊及內部探及豐富、雜亂條狀或星點狀血流信號，Adler分級為Ⅲ級。實驗大鼠NAC后腫瘤直徑較NAC前明顯縮小，CDFI顯示，與NAC前相比血流信號減少，Adler分級為0～Ⅰ級。（圖2）

圖2 空白對照及實驗大鼠超聲顯像圖

2.4 實驗組大鼠NAC前后病理染色情況

實驗組大鼠NAC前腫塊大體呈不規則或結節狀，切面灰白或灰粉，可見灰白條紋，質地硬，鏡下可見腫瘤細胞呈索狀、梁狀、團塊狀、腺管狀、實性片狀等；細胞較大，成不同形狀；細胞核明顯多形性，核仁明顯，可有多個核仁，核分裂像不等；腫塊間質為浸潤的淋巴細胞壞死和鈣化等；部分累及脈管或神經，腫瘤新生血管明顯。實驗組33只大鼠NAC后腫瘤明顯縮小，光鏡下殘余浸潤性腫瘤部分表現為纖維間質內散在的條索狀、巢狀或單個的腫瘤細胞。NAC后，1只大鼠表現為較大的片狀癌巢，其余多數大鼠腫瘤間質表現為纖維化或纖維黏液樣，伴有不等的淋巴細胞、組織細胞、多核巨細胞浸潤，可見鈣化形成及含鐵血黃素沉著，部分腫瘤壞死后可形成膽固醇結晶，腫瘤新生血管明顯減少。（圖3）

圖3 實驗組大鼠NAC前后病理染色情況（HE染色，×20）

3 討論

2020年全球腫瘤數據顯示，乳腺癌在女性人群中的發病率已經超過肺癌，是目前女性最常見的惡性腫瘤。中國女性乳腺癌發病率也居首位，占女性各種腫瘤的7%～10%。NAC是局部晚期乳腺癌治療的有效手段，并且可以使患者明顯受益，但由于不同NAC方案引起腫瘤降期不同，并不能讓所有乳腺癌患者都達到遠期獲益。Cao等的研究認為，乳腺癌患者接受NAC后，35%患者腫瘤消失達到CR，僅9%的患者達到PCR。目前評價NAC后腫瘤緩解最有效的方法是病理學檢查，而病理學有創操作給患者帶來較大的痛苦，同時也限制了其在臨床上的應用。因此，利用無創方法準確評估乳腺癌患者NAC后療效及手術時機把握尤為重要。

已有大量文獻證明腫瘤的生長與腫瘤新生血管有關，Batlle等通過抑制間充質干細胞p38α激酶活性可使血管新生明顯，進而增加了小鼠結腸腫瘤的發生率。Nuevo-Tapioles等研究發現，Nebivolol作為β1受體阻斷劑可抑制內皮增殖進而抑制腫瘤血管生成，從而限制了結腸癌和乳腺癌的生長。Zhou等研究發現，楊梅素可下調血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）2和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），其具有明顯抑制腫瘤血管生成的作用，進而抑制乳腺腫瘤的生長。本研究結果顯示，大鼠乳腺癌形成后病理切片顯示腫瘤新生血管明顯，而給予化療藥物治療后腫瘤直徑縮小，新生血管明顯減少，說明乳腺癌的發生與腫瘤新生血管密切相關，并且彩色多普勒超聲顯示NAC前CDFI中腫物周邊及內部探及豐富、雜亂條狀或星點狀血流信號，Adler分級為Ⅲ級，NAC后超聲探及腫瘤大小較NAC前明顯縮小，CDFI：與治療前相比血流信號減少，血流信號減少，Adler分級為0～Ⅰ級。RGD是構成骨橋蛋白的一種生物活性多肽，近年研究認為其參與多種生物學過程，如新生血管形成、腫瘤發生侵襲轉移、免疫調節等。研究顯示，RGD介導的生理功能通過與細胞表面的整合素αβ結合發揮作用。αβ是參與細胞間粘附和信號轉導的重要物質，在腫瘤增殖、轉移、分化、凋亡起著重要作用。多項研究表明，αβ在乳腺癌新生血管形成中有重要作用，且αβ表達于各種乳腺癌細胞，并與腫瘤新生血管數目呈正相關，而在正常組織不表達或很少表達，提示其與乳腺癌新生血管形成有關。Engebraaten等用免疫組化分析發現利用抗整合素單克隆抗體能有效阻止新生血管內皮細胞αβ的表達，導致內皮細胞的凋亡和血管的消退，乳腺癌細胞生長受到抑制。更進一步的研究發現，阻斷RGD和整合素αβ結合可明顯減少雞胚絨毛尿囊膜新生血管的形成，而對已生成的血管沒有影響。總之，RGD與乳腺癌病理過程的發生、發展和預后密切相關，RGD與整合素αβ結合將為乳腺癌的診治提供靶點。

Tc-3PRGD能特異與細胞整合素αβ結合并在SPECT顯像，該技術用于腫瘤新生血管的檢測，并被證實是靈敏度高和特異性好的方法，對腫瘤微環境及形態的變化可以進行早期、微觀及宏觀的評估。Tc-3PRGDSPECT在多種疾病的早期診斷中都有應用，Wu等認為Tc-3PRGDSPECT可以通過對相關滑膜新生血管的成像發現早期類風濕性關節炎，并可應用于疾病管理中。Zhang等研究發現，Tc-3PRGDSPECT可提供一種非侵入性肝纖維化分級和評估肝纖維化逆轉的方法。有研究表明，使用Tc-3PRGD探討乳腺癌NAC后患者評價治療反應時，Tc-3PRGDSPECT在第一個周期NCT后的靈敏度、特異度和陰性預測值分別為86.7%、85.7%和86.7%，在第二個周期NCT后的靈敏度、特異度和陰性預測值分別為92.9%、93.3%和93.3%；其中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性組T/NT值高于其他乳腺癌亞型，且T/NT值變化較大（

P

＜0.05），HER2陽性組中T/NT值的變化與腫瘤病理反應有很強的相關性（

P

＜0.03），說明Tc-3PRGDSPECT顯像可較好地評價乳腺癌NAC后療效的無創方法。本研究利用Tc-3PRGDSPECT顯像觀察實驗組大鼠NAC治療前后顯像劑攝取變化，結果顯示，實驗組NAC前后大鼠左側腋窩部位T/NT值、T/NT值均高于空白對照組，但均低于NAC前，與病理學檢查結果基本一致，因此，Tc-3PRGDSPECT可為早期評估乳腺癌NAC療效提供更多的理論依據。

綜上所述，Tc-3PRGDSPECT顯像可以較好地評價乳腺癌NAC后的療效，與病理學檢查相比，其是一種無創的診斷方法。但本研究也存在一些不足，如病理學研究只是在原先實驗基礎上和文獻報道上，未能行免疫組織化學染色進一步說明αβ的表達情況。由于造模大鼠較少，實驗結果可能存在一定偏倚，今后的臨床和科研工作中應進一步探索及驗證。