陳超，孫建飛，魏海梁，馮冠強

1陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712000

2陜西中醫藥大學附屬醫院普外科，陜西 咸陽 712000

目前，結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第二大可導致腫瘤相關性死亡的疾病，其易轉移及不良預后的特點，不斷地為臨床工作帶來挑戰。基質細胞在腫瘤進展和治療反應中具有重要意義。腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中最活躍的組成部分，可通過分泌各種趨化因子和細胞因子與腫瘤細胞相互作用促進腫瘤血管生成、細胞增殖、遷移和轉移。同時，許多 miRNA（miRNA-1246、miRNA-21、miRNA-329、miRNA-181a、miRNA-199a、miRNA-92a-3p、miRNA-17-5p和miRNA-24-3p等）組成的新型外泌體信號增強了CAF與腫瘤間的信息交流。外泌體miRNA通過靶向抑制目的基因在結直腸癌的增殖、遷移、侵襲、轉移、干性、細胞耐藥中發揮重要作用。因此對于CAF來源外泌體miRNA在此過程中扮演的角色越來越受到人們的關注。本文就CAF外泌體miRNA在TME中對CRC的影響作一綜述，以期為深入探究CAF在CRC中的作用提供新的線索。

1 CAF與CRC

1.1 CAF

成纖維細胞是結締組織最常見的成分，是腫瘤中CAF的主要來源之一。一般狀況下，它們處于靜止期，在有絲分裂中是無活性的，直到它們響應組織損傷或對不同類型的壓力時，成纖維細胞的表型轉化為激活狀態。腫瘤可以比喻為“無法愈合的傷口”，腫瘤基質細胞的重建過程與傷口愈合有一些共同的相似之處。在腫瘤發生過程中，常駐成纖維細胞被腫瘤細胞和免疫細胞的信號激活，由此被稱為CAF。這些信號分子包括CAF激活劑轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）配體（如血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子和表皮生長因子）以及促炎分子[如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6]，它們通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活駐留的成纖維細胞。另外，環境應激[如反應性氧物質、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）剛度等]和化療或放療引起的DNA損傷可通過JAK-信號轉導與轉錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）途徑激活CAF。而活化的CAF常特異性表達平滑肌肌動蛋白（a smooth muscle actin，a-SMA）、成纖維細胞活化蛋白-α（fibroblast activation protein-α，FAP-α）、成纖維細胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）或血小板源性生長因子受體-β（platelet-derived growth facter receptor-β，PDGFR-β）等標志分子。

1.2 CAF與CRC

研究發現CAF活化是ECM蛋白質合成和分泌的一個關鍵事件，導致ECM重塑和增加腫瘤細胞的侵入性。CAF和腫瘤細胞之間是通過復雜的信號網絡介導的，每種細胞類型通過協同或拮抗的信號轉導軸相互影響。大量體外和體內研究已揭示CAF可通過生長因子、趨化因子、基質細胞衍生因子1等腫瘤相關因子的釋放和ECM重塑影響CRC的進展。此外盡管miRNA表達及功能對CAF和腫瘤細胞之間相互作用的影響尚未完全闡明，但有關證據表明，源自CAF的外泌體中的miRNA失調通過多種機制影響腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉移和治療抵抗，最終調節腫瘤的進程。

2 外泌體miRNA

外泌體是脂質雙層形成的40～100 nm的細胞外囊泡，參與各種生理和病理過程。它們可以在細胞之間穿梭以促進細胞間的通訊，在腫瘤增殖、侵襲、轉移等方面發揮關鍵作用，并且可通過修飾受體腫瘤細胞中的基因表達來增強化學抗性和放射抗性。研究已經表明，外泌體能夠承載多種類型的分子以促進細胞間通訊，如miRNA、mRNA、長鏈非編碼RNA、DNA、蛋白質和脂質。

miRNA是由外泌體遞送的重要貨物。miRNA通常由19～25個小型單鏈非編碼RNA組成，可以調節靶基因的轉錄后沉默。miRNA基因轉錄后，會產生一個稱為pre-miRNA的小發夾狀RNA。pre-miRNA被輸出到細胞質后被RNA酶Ⅲ型內切核酸酶處理，隨后釋放小RNA雙鏈體。加載到AGO蛋白上并形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）后，RNA雙鏈體將解開。一旦與RISC結合，miRNA將與mRNA互補配對。根據miRNA和mRNA是否完全結合，會發生兩種不同的機制：①如果miRNA與mRNA足夠互補，則mRNA會裂解。②當miRNA與mRNA有不充分互補則翻譯被抑制。因此，miRNA可以調節各種生理和病理活動。

3 外泌體miRNA與CRC發展的關系

CRC是一種異質性疾病，各種信號通路在其進展中起著關鍵作用。TME中的外泌體miRNA被認為是惡性轉化的誘因。外泌體miRNA作為介導腫瘤進展和抑制的細胞間信號分子，可以針對腫瘤進展中涉及的通路成分，最顯著的是

APC

、

KRAS

和

p53

，它們可以作為CRC中的致癌基因或抑癌基因。已有證據表明，CAF外泌體含有的miRNA可以影響腫瘤細胞增殖、血管生成、轉移、凋亡、細胞周期調節和轉移。因此，放松miRNA管制會影響腫瘤的生長。

3.1 外泌體miRNA促進CRC增殖及相關血管生成

腫瘤細胞的增殖是腫瘤進展中最重要和最基本的步驟。除了如前所述的各種細胞因子或趨化因子，外泌體miRNA生長抑制相關的細胞周期蛋白在腫瘤細胞增殖的調控中發揮重要角色。

CCNG2

是負責編碼與生長抑制相關的細胞周期蛋白G2（cyclin G2，CycG2）的基因，CycG2的下調可導致多種腫瘤的生長增強。因此，CCNG2的下調可導致腫瘤細胞在G/G期的比例降低。而CAF外泌體miRNA-1246可靶向抑制CCNG2表達來介導CRC的惡性進展。并且CAF外泌體通過TGF-β信號通路促進CRC進展。例如，CAF外泌體miRNA-17-5p直接靶向RUNX家族轉錄因子3（RUNX family transcription factor 3，RUNX3）。RUNX3與原癌基因

MYC

相互作用并與TGF-β1的啟動子結合，從而激活了TGF-β信號通路。RUNX3/MYC/TGF-β1通路刺激 TGF-β1釋放活化的CAF分泌更多的miRNA-17-5p，從而導致CAF大量激活，促進CRC增殖、化學抗性和轉移。

同樣，血管生成是滿足實體瘤生長所需營養的關鍵過程。血管生成對應于主要血管網絡的萌芽、重塑和擴張，由原有血管形成新血管。腫瘤細胞會在周圍環境中產生并分泌因子，從而促進新血管的生長，該過程受到包括血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子和TGF-β在內的幾種生長因子的嚴格調控。在這些生長因子中，TGF-β是一種多功能的細胞因子，可以調節內皮細胞（endothelial cell，EC）（血管的主要成分）的兩種不同的Ⅰ型受體，即激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALK）1和ALK5之間的信號轉導體內平衡。ALK1是內皮細胞限制性TGF-βⅠ型受體，可誘導SMAD1/5/8磷酸化增強血管生成。而ALK5可以促進SMAD2/3的磷酸化，并抑制EC的增殖、遷移和血管形成。SMAD1/5/8信號和SMAD2/3信號之間的激活比例最終決定了EC是否開始增殖或保持靜止。miRNA-1246直接靶向PML（ALK1-SMAD2/3信號的調節劑），從而抑制SMAD2/3信號，這種信號的失活導致SMAD1/5/8信號的相對激活，從而促進血管生成。

3.2 外泌體miRNA促進CRC遷移、侵襲和轉移

在大多數CRC患者中腫瘤細胞向遠處器官的擴散，往往預示著不良的生存期。miRNA-21具有對若干腫瘤類型的致癌效應已被廣泛接受，其最充分的描述是與腫瘤抑制因子磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）的相互作用。實驗證明外泌體miRNA-21可直接與PDCD4的3'-UTR結合，抑制PDCD4活性，從而導致侵襲能力增強。CAF以多種方式對腫瘤的侵襲、遷移和轉移發揮作用。CAF中的miRNA失調也可以通過調節ECM重塑來介導腫瘤細胞的侵襲和轉移。在鑒定CRC中亞組特異性miRNA和功能基因集的聯合回歸模型中發現，某些miRNA可以調節ECM靶基因。實驗證明，外泌體中miRNA-19、miRNA-17和miRNA-200c的高表達可以在蛋白質水平調節ECM靶基因的表達，調節ECM重塑從而增強腫瘤細胞的侵襲力。相關研究表明，纖溶酶原激活劑抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）作為一種分泌蛋白，是CAF與上皮腫瘤細胞間串擾的重要中介物，可觸發上皮樣腫瘤細胞的生長和極性變化。而miRNA-200b、c/NF-κB軸可借由增加PAI-1的表達，誘導腫瘤細胞發生極性消失，例如E-鈣黏蛋白減少和波形蛋白增加，從而增強其侵襲性。通過共培養或異種移植實驗所證實，CAF中的其他miRNA也參與體外或體內腫瘤的侵襲、遷移和轉移。

3.3 外泌體miRNA激活CRC干性

在腫瘤的發生、發展和治療抵抗中部分細胞群具有巨大的自我更新和分化潛力，這些細胞被定義為腫瘤干細胞，其干性的獲得和維持受到許多因素影響。CAF促進干性的能力已被廣泛研究，但CAF衍生miRNA在干性調控中作用的研究相對較少。FBXW7和MOAP1分別是重要的促凋亡腫瘤抑制分子，MOAP1與最主要的凋亡基因

BAX

結合可誘導細胞凋亡。研究發現FBXW7和MOAP1的過表達可促進β-catenin的泛素化降解來抑制WNT/β-catenin途徑并促使線粒體凋亡，最終抑制細胞干性和促進細胞凋亡。CAF外泌體miRNA-92a-3p通過靶向抑制FBXW7和MOAP1促進腫瘤細胞干性和EMT并抑制細胞凋亡，同時可增強對5-氟尿嘧啶/奧沙利鉑的抗性。總體而言，miRNA代表CAF調節干性的重要方式，值得進行更深入和廣泛的探索。

3.4 外泌體miRNA促進CRC耐藥

研究證明，CAF與治療耐藥性和不良預后密切相關。CAF可通過多種機制來增強腫瘤的治療抗性，包括分泌旁分泌信號轉導介質（如細胞因子和外泌體）、預防藥物輸送、重新編程新陳代謝和信號通路的調節。miRNA在這些過程中也起著不可替代的作用。在CAF外泌體對卵巢癌順鉑耐藥的探索中發現CAF衍生的miRNA-98-5p與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）之間存在關聯。剔除下游目標

CDKN1A

可以促進卵巢癌細胞的順鉑耐藥性，增加卵巢癌細胞的增殖，并減少以前對順鉑敏感細胞的凋亡。這項研究幫助闡明了CAF通過miRNA-98-5p介導的CDKN1A抑制卵巢癌治療耐藥性的潛在機制。研究發現與過度表達miRNA-21的成纖維細胞共培養可以保護結直腸癌細胞免受奧沙利鉑誘導的細胞凋亡，并增加這些細胞的增殖能力。并且在卵巢癌耐藥的機制研究中發現，將CAF轉移到腫瘤細胞的外泌體miRNA-21不僅促進細胞侵襲，而且通過與凋亡酶激活因子結合抑制細胞凋亡并誘導紫杉醇耐藥。研究發現，尾端相關同源盒2（caudal type homeobox 2，CDX2）/肝素軸在結腸癌的甲氨蝶呤抗性中起作用，CDX2的過表達可以降低結腸癌細胞對甲氨蝶呤的抗性。在結腸癌進展過程中CAF外泌體miRNA-24-3p通過抑制CDX2對肝素表達的強化作用，提高了結腸癌細胞對甲氨蝶呤的抵抗力。研究表明，在胃癌的背景下，CAF分泌外泌體miRNA-522通過靶向花生四烯酸脂氧合酶15抑制腫瘤細胞的肥大化，阻斷有毒脂質過氧化物的積累，從而防止了肥大化導致的非凋亡性細胞死亡。

3.5 外泌體miRNA促進CRC放療抵抗

為了有效減少局部晚期或播散性CRC患者局部復發，非手術聯合放射治療越來越受到重視。但CRC細胞對放療的抵抗力對于患者預后具有不良影響。CAF衍生的外來體的研究為臨床工作者提供了新的候選目標。研究發現，輻照引起G/S期細胞周期過渡延遲和細胞凋亡促進。叉頭框蛋白A1（fork head box A1，FOXA1）可以與目標基因的啟動子結合，以影響腫瘤細胞周期。FOXA1的上調提高了G期細胞的比例，降低了S期細胞的比例，并提高了細胞凋亡率。輻照后，細胞中FOXA1更為顯著過表達。FOXA1可以負調控TGF-β3的轉錄，并防止其轉位入核抑制TGF-β信號通路、G/S期細胞周期過渡。在線分析網站Targetscan揭示了miRNA-93-5p和FOXA1之間存在特定的結合位點。攜帶外泌體miRNA-93-5p的CAF通過下調FOXA1促進CRC細胞的化學抗性。并且在SW620和HCT116細胞中引入miRNA-145會降低干細胞和放療的抵抗力。研究證實，CAF外泌體miRNA-590-3p也在CRC發展中發揮作用。已經發現氯化物通道附件4（chloride intracellular channel 4，CLCA4）充當腫瘤抑制因子，能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/絲氨酸/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號轉導途徑來阻止膀胱癌細胞的惡性表型。并且在肝癌的研究中也已經發現CLCA4可通過抑制PI3K/AKT信號通路來預防疾病的發展。同時PI3K/AKT信號通路的激活與各種腫瘤的抗輻射能力密切相關，可見PI3K/AKT途徑的激活導致對多種針對腫瘤的療法產生抵抗力。通過數據庫生物信息學分析發現，

CLCA4

可能作為miRNA-590-3p的靶基因被抑制，以此增強了CRC細胞對輻射的抵抗力。因此PI3K途徑抑制劑化療藥物增敏劑也應用于臨床。并且另一研究發現miRNA-590-3p還具有通過直接靶向免疫球蛋白樣結構域蛋白1來促進人類膠質母細胞瘤細胞對放療的抗性能力。

4 CAF中的miRNA作為腫瘤生物標志物

盡管近年來，CRC的檢出率不斷提高，然而其早期診斷率僅達到30%～40%，剩余的一大部分患者錯失了最佳的根治性手術時機，導致其預后不良。所以，有效檢測生物標志物無疑將大大有助于腫瘤患者的治療和延長生存時間。因此，除了研究miRNA在CAF與腫瘤細胞之間的相互作用外，許多研究已經開始考慮CAF外泌體中miRNA作為預后生物標志物的潛能。在對照CRC患者和健康個體的血清外泌體miRNA表達水平中發現，與健康個體相比，CRC患者的miRNA-21、miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p水平均明顯更高，甚至可將CRC與健康個體準確區分開，且在手術后CRC患者miRNA的表達水平降低到健康個體水平。并且miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p對健康個體與CRC患者進行分類中，曲線下面積分別為0.845和0.897。另外，在CRC的癌前病變-腺瘤階段受試者血清中的外泌體miRNA-29a和miRNA-21的表達水平與健康個體有明顯差異，同時發生肝轉移與CRC原發性腫瘤患者組織血漿中外泌體miRNA-21表達水平上調，且總生存率較低。所以，miRNA作為診斷及評價患者預后標志物的潛力毋庸置疑。

5 小結

目前研究發現CAF在CRC的疾病進展中發揮重要作用。在CAF外泌體相關研究中發現miRNA能夠通過腫瘤細胞間信號通訊促進腫瘤細胞增殖、上皮-間充質轉化、侵襲、誘導血管生成和代謝重編程。但現有大多數研究都集中在由單個miRNA介導的單個信號轉導途徑的機制上。實際上一個miRNA能夠抑制多個基因的表達，一個靶基因也受多個基因調控。上述研究缺乏對TME中復雜的調控網絡的進一步研究，研究結論僅涉及大型復雜網絡的一部分。在臨床治療中利用繁雜的單一目的miRNA抑制劑抑制相關miRNA表達和目標外泌體的包裝過程，盡管都能取得一定的效果，卻難以提供確切指導。而直接干預細胞外泌體的釋放，難免對其他“貨物”的運輸產生影響，帶來不良結局。而且盡管現在未在CRC中明確發現抑癌CAF外泌體miRNA，但已證實在胃癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤背景下，CAF的外泌體釋放可以抑制腫瘤的進展和轉移，降低腫瘤細胞對化學治療的抗性。同時，CAF既是miRNA的供體，同時腫瘤細胞所分泌的許多外泌體要發揮效應也需要CAF的參與。因此，在不同種類的腫瘤及其腫瘤相關細胞中鑒定最佳的靶標miRNA及miRNA群具有重要意義，也是外泌體miRNA應用于臨床的最大挑戰。同時，對CAF中miRNA的深入研究不僅是為了設計針對miRNA的治療方法，也是為了進一步了解CAF的性質和生物學特征，并且可能有助于探究針對CAF的其他治療方法。