醫療器械生物學評價中替代方法的應用

黎硯書 徐麗瑛 肖小華

摘要：綜述了在3R運動和體外科學技術的推動下，各國替代方法在化學品及化妝品毒性測試中的驗證和法規認可現狀。討論了替代方法在皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏、全身毒性、遺傳/生殖/發育毒性等毒理學終點的應用。最后提出，生物安全評價作為醫療器械的重要評價指標，醫療器械的動物替代方法也將成為趨勢，上述替代方法均可嘗試在醫療器械的生物安全評價中使用。

關鍵詞：醫療器械 替代方法

【中圖分類號】R197.39 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）11-01

自1959年Russel和Burch發表《人道實驗技術原理》一書中第一次提3R（reduce、refine、replace）理論以來，尤其從2013年3月11日起，歐盟委員會下令全面禁止用動物對化妝品的安全性測試和銷售，包括化妝品成分。以減少、優化和替代為核心的動物試驗替代方法已經被愈來愈多的的科學家所接受，在實際研究工作中得到了廣泛的應用。醫療器械作為人類生活的必需品，保證其臨床使用的安全越來越受到各國政府和學術界的重視。因此，在醫療器械領域減少動物的使用，甚至完全替代動物試驗也將是一種趨勢。那么開發和研究適用于醫療器械安全性評價的體外替代方法勢在必行。本文就可用于醫療器械生物學評價的替代方法做一簡述，為開發和研究適用于我國醫療器械安全評價替代方法提供參考。

1 世界各國動物實驗禁令現狀

歐盟于2013年3月全面禁止化妝品動物實驗并禁止銷售經過動物測試的化妝品，同時要求成員國禁止進口違反上述禁令的化妝品。

除了歐盟以外，挪威在2013年與歐盟同步禁止了化妝品的動物試驗。以色列自2007年5月起禁止化妝品、個人護理用品和洗滌劑進行動物實驗，2013年1月實施銷售禁令。2014年5月印度開始禁止使用動物進行化妝品測試，自2014年11月起禁止進口經動物檢測的化妝品。澳大利亞于2014年和2016年先后提出終止殘忍議案，從2017年起禁止實施化妝品動物試驗及銷售經過動物試驗測試的化妝品。2015年新西蘭開始禁止化妝品及成分在研發、生產、測試、教學中使用動物試驗。2017年巴西在2014年禁止化妝品動物試驗法案基礎上進行的修改，禁止成品和原料的動物試驗。2018年韓國全面禁止成品和原料的動物試驗。自2019年開始中國臺灣省禁止化妝品成品及原料的動物試驗。零殘忍化妝品測試法規已成為全球趨勢。

2 在醫療器械生物安全評價中的應用

在以歐盟為代表的化學品和化妝品動物實驗禁令的實施，各國政府及學術界均投入大量人力物力開發替代方法，同時驗證機構、標準化組織和監管機構也加快了替代方法的認可速度，多項替代方法已獲認可或已向經濟合作與發展組織（OECD）提交草案的方法，還有很多新的方法正在開發和驗證的程序中[1～2]。

醫療器械生物安全性評價目前涉及的項目除細菌內毒素試驗、細胞毒性試驗、溶血試驗、部分遺傳毒性試驗、部分血液相容性試驗等項目是體外方法外，其余項目都是在動物體內進行的，因此，尋求可用的替代方法對于減少和替代動物的使用至關重要。

2.1 皮膚刺激替代方法

目前，經過OECD驗證的用于皮膚腐蝕的新的替代方法包括重組人表皮模型（RHE）、體外膜屏障試驗方法、大鼠經皮膚電阻試驗，用于皮膚刺激的替代方法有重組人表皮模型試驗。

根據ECVAM科學咨詢委員會發布公告，EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic這3種組織工程皮膚模型能夠根據OECD TG431操作指南來區分腐蝕性和非腐蝕性化合物，可以將其作為皮膚腐蝕性化合物檢測的動物替代方法[3-4]。在2014年9月歐萊雅在中國獲得人體皮膚重建模型EpiSkin的營業執照，開啟了組織工程在中國的研究與應用[5]。

2.2 皮膚致敏替代方法

根據皮膚致敏的機制而設計的離體試驗，包括直接多肽反應試驗（DPRA），基于ARE-Nrf2通路的熒光酶試驗，人細胞系活化試驗（h-CLAT）。DPRA試驗是利用受試物與合成的兩條7肽寡肽鏈氨基酸（分別為半胱氨酸多肽和賴氨酸多肽）在體外環境中結合，然后通過液相色譜發分析反應前后兩種氨基酸曲線下面積來分析受試物與氨基酸的結合率來預測受試物的引起過敏的可能性。Masaaki[6]等利用人單核白血病細胞（THP-1）以CD86和CD54為指標建立了皮膚致敏性的體外評價體系，即人細胞系活化試驗。THP-1細胞與不同濃度2，4-二硝基氯苯（DNCB）共培養24小時后，采用流式細胞術檢測共刺激分子CD86與CD54表達變化，以及細胞活力與CD86/CD54表達的關系[7]。利用已知致敏劑DNCB處理后，共刺激分子CD86與CD54表達都增加，而非致敏劑DMSO和SLS處理后觀察不到此變化[8]。

2.3 全身毒性替代方法

全身毒性包括急性、亞急性、亞慢性和慢性全身毒性。OECD于 2010 年正式發布“利用細胞毒性試驗預測急性毒性經口毒性試驗初始劑量”的指導原則。ECVAM提出正常人角質細胞或Balb/c 3T3細胞中性紅攝取試驗可以用于確定急性毒性起始劑量。曾麗海[9-10]研究也顯示BALB/c 3T3 細胞中性紅攝取試驗能夠較好地預測急性毒性。除此之外，OECD于2001年發布了3種急性經口實驗替代方法的最新修訂版，并于2002年廢除了傳統的實驗方法，我國則于2008年將上述方法接納為化學品檢驗國家標準。譚劍斌[11]等采用3種替代法（固定劑量法、急性毒性分級法和上下法）與傳統實驗方法的比較，參照OECD TG423進行，研究結果與傳統實驗方法間具有較高一致性和相關性，且此3種方法所使用的動物比傳統方法明顯減少，因此他認為這3種方法具有取代傳統檢測方法的潛力。

其余全身毒性試驗尚無驗證的替代方法。步犁等[12]認為有些化學物雖然急性毒性作用極低，卻有可能亞慢性或慢性毒性.如某些重金屬、氫醌、苯胺類、肽酸酯類等，因此查明受試物（如化妝品）中可能含有的具有慢性毒性作用的化學物，評估其反復接觸后產生的健康風險是保障化妝品消費安全的關鍵措施之一。

2.4 遺傳/生殖/發育毒性替代方法

遺傳毒性試驗是采用哺乳動物或非哺乳動物細胞、細菌、酵母菌或真菌測定受試物樣品是否引起基因突變、染色體結構畸變以及其他DNA或基因變化的試驗，根據《GBT 16886.3-2008醫療器械生物學評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗》規定，細菌基因突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗和哺乳動物細胞誘裂性試驗體外試驗結果均為陰性，為避免動物的過度使用，通常不再論證并不宜再進行動物遺傳毒性試驗;若全部結果均為陽性，則應進行體內誘變性試驗，否則推定該化合物為誘變物。

根據《GBT 16886.3-2008醫療器械生物學評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗》規定，在確定進行生殖和發育毒性試驗之前，應在評價醫療器械使用中引發生殖和發育毒性風險的基礎上對進行試驗的決定予以論證;對可吸收醫療器械或含可溶出物質的醫療器械，如果在吸收、代謝和分布研究方面有充分可靠的數據，或材料或醫療器械浸提液中鑒別出的所有成分均無生殖和發育毒性時，就無需進行生殖毒性試驗;對醫療器械進行可接受的生物學風險評估后，如生殖和發育毒性的風險已被排除，則無需進行動物試驗。

3 結語

醫療器械作為人類生活的必需品，保證其臨床使用的安全越來越受到各國政府和學術界的重視。上述所有的國外化學品及化妝品領域應用的替代方法均可嘗試在醫療器械的生物安全評價中使用。以上這些替代方法將大大節省動物資源和安全性評價投入。而我國目前還沒有建立醫療器械非動物體外毒理學研究方法，無法實現與歐盟、美國、OECD等國家和國際組織先進方法的接軌。 尋求可用的醫療器械替代方法可積極響應3R的倡導，以及為我國醫療器械替代方法驗證提供參考，盡量排除我國進出口貿易因動物試驗而存在的技術壁壘。

參考文獻：

[1] 瞿小婷，程樹軍，劉超，等. 《日用化學品安全評價技術創新——替代方法》專題一 國際化學品安全評價動物替代測試法規趨勢[J]. 日用化學品科學. 2016（02）： 11-16.

[2]程樹軍.動物實驗替代技術研究進展[J].科技導報，2017，，35（24）：40-47.

[3] Kandarova H， Liebsch M， Spielmann H， et al. Assessment of the human epidermis model SkinEthic RHE for in vitro skin corrosion testing of chemicals according to new OECD TG 431[J]. Toxicol In Vitro. 2006， 20（5）： 547-559.

[4] Cotovio J， Grandidier M H， Portes P， et al. The in vitro skin irritation of chemicals： optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process[J]. Altern Lab Anim. 2005， 33（4）： 329-349.

[5] 鄒運動. 含有表皮層、真皮層和皮下脂肪層結構組織工程皮膚的構建[D]. 西北農林科技大學， 2008.

[6] Miyazawa M， Ito Y， Yoshida Y， et al. Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens[J]. Toxicol In Vitro. 2007， 21（3）： 428-437.

[7] 田勝慧，柯軍，楊立峰，等. 一種皮膚致敏體外替代方法介紹-人細胞系激活試驗[J]. 中國比較醫學雜志. 2013（12）： 48-51.

[8] Yoshida Y， Sakaguchi H， Ito Y， et al. Evaluation of the skin sensitization potential of chemicals using expression of co-stimulatory molecules， CD54 and CD86， on the naive THP-1 cell line[J]. Toxicol In Vitro. 2003， 17（2）： 221-228.

[9] 曾麗海，趙敏，楊杏芬，等. 應用3T3細胞中性紅攝取試驗預測化學物質急性毒性的探討[J]. 毒理學雜志. 2011（06）： 438-441.

[10] 曾麗海，黃振烈，楊杏芬，等. 人正常角化細胞中性紅攝取試驗預測化學品急性毒性的研究[Z]. 中國湖北武漢： 20151.

[11] 譚劍斌，趙敏，楊杏芬，等. 3種替代方法在急性經口毒性實驗中應用研究[J]. 中國職業醫學. 2011（S1）： 1-4.

[12] 步犁，程樹軍，談偉君. 揭秘化妝品安全性評價技術（十）——慢性毒性試驗及其替代方法[J]. 中國化妝品（行業）. 2012（06）： 58-64.