柴胡皂苷A減輕腦缺血再灌注大鼠海馬神經元損傷

馬大亮， 崔紅莉， 榮衛江， 賈琦， 黃福獻

1.新疆維吾爾自治區第三人民醫院腦病中心，烏魯木齊 830000； 2.新疆心腦血管病醫院神經內科，烏魯木齊 830000 3.新疆醫科大學第六附屬醫院建工醫院神經外科，烏魯木齊 830000

腦血管疾病是危害老年人健康的常見疾病，具有發病率高，致殘率高，死亡率高的特點[1]。腦缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷是缺血區域的血

流再灌注導致嚴重的腦損傷和相關功能障礙[2]。近年來，中藥對腦缺血再灌注損傷的防治受到重視。柴胡皂苷A（Saikosaponin A，SA）是一種從藥用植物柴胡中提取的三萜皂苷，具有抗炎和抗氧化作用[3]。據報道，在體外，柴胡皂苷A能抑制LPS誘導的原代小鼠巨噬細胞中TNF-α和IL-1β的產生[4]，能抑制LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞的炎癥和氧化應激[5]。在體內，柴胡皂苷A可通過抑制NF-κB活化來預防實驗性敗血癥[6]，還可保護小鼠免受葡聚糖硫酸鈉誘發的結腸炎[7]。然而，目前尚未見報道柴胡皂苷A對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。腦缺血引起的腦組織損傷的病理機制很復雜，包括炎癥反應，氧化應激，細胞凋亡等[8]。沉默信息調節器1（silent information regulator 1，SIRT1）是細胞周期調節因子，是能量代謝和基因穩定的關鍵基因，也是缺血性腦血管病的潛在治療靶點[9]。本研究主要探討柴胡皂苷A對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元損傷和氧化應激、SIRT1水平的影響，期為防治缺血性腦血管疾病的臨床應用和實驗研究提供依據和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 柴胡皂苷A（HPLC＞98%，批號：20180213；規格：1 g）購自美國Sigma公司；尼莫地平（HPLC＞98%，批號：20170826；規格：50 mg）購自上海士鋒生物科技有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（批號：20180521）購自美國PIERCE公司；MatrigelTM底膜基質（批號：20170816）購自美國BD公司；Caspase3抗體（批號：20180219），Caspase9抗體（批號：20180313），Bax抗體（批號：20170427），Bcl-2抗體（批號：20170506），SIRT1抗體（批號：20170422）購自美國Sigma公司；HRP標記的山羊抗大鼠二抗（批號：20180602）購自美國Santa Cruz公司；大鼠CKMb ELISA試劑盒（批號：20180608），Mb ELISA試劑盒（批號：20181011）購自武漢博士德生物工程有限公司；SOD試劑盒（批號：20170229）、MDA試劑盒（批號：20170512）、LDH試劑盒（批號：20170324）購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 Varioskan Flash多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；OLYMPUSDP71顯微鏡（日本奧林巴斯光學有限公司）；高速低溫離心機（Beckman公司，美國）；電泳槽，電轉儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統GDS-800 UVP（美國UVP公司）。

1.1.3 動物 選用54只SPF級健康成年雄性SD大鼠，鼠齡8個月，體重240～280 g，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，生產許可證號：SCXK（新）2016-0001。所有動物實驗符合動物倫理委員會標準。實驗動物在標準條件下適應性飼養1周后用于實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 隨機分為6組，每組9只大鼠，分別為假手術組（Sham）；模型組（I/R，雙側頸總動脈結扎術建立腦缺血再灌注模型）；柴胡皂苷A 1 mg/kg組（I/R+SA 1 mg/kg）；柴胡皂苷A 5 mg/kg組（I/R+SA 5 mg/kg）；柴胡皂苷A 10 mg/kg（I/R+SA 10 mg/kg）；尼莫地平1 mg/kg組（I/R+NMDP 1 mg/kg）。建模成功后分別用1、5、10 mg/kg的柴胡皂苷A或1 mg/kg尼莫地平灌胃給藥，每日給藥1次，給藥容積是1 ml，連續給藥7 d。假手術組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 腦缺血再灌注模型構建方法 將大鼠仰臥位固定，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，分離雙側頸總動脈（common carotid artery，CCA）用微動脈夾夾閉10 min，松開10 min，再夾閉10 min復制大鼠腦缺血再灌注模型[10]。

1.2.3 腦損傷指標檢測 記錄各組大鼠跳臺實驗犯錯次數，Y迷宮實驗檢測新異臂進入次數；然后處死大鼠，取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干后稱濕重，置于培養皿中，濾紙吸干表面水分，入烘箱90℃烘干后取出，經多次稱量直至恒重后記錄，作為組織干重。計算腦含水率及腦指數。

腦含水率（%）＝（濕重-干重）/濕重×100%；腦指數＝腦濕重/體重×100

1.2.4 HE染色觀察腦組織病理損傷 取部分腦組織放入4%多聚甲醛溶液進行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色：將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學顯微鏡拍照，觀察其形態特征。

1.2.5 尼氏小體染色檢測神經元凋亡 取部分腦組織放入4%多聚甲醛溶液固定30 min，將標本移至30%蔗糖溶液約72 h，OCT膠進行包埋，再進行冰凍切片。將腦片置于尼氏液中室溫下染色10 min；75%、95%、100%酒精各脫色1 min，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察照相。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白和SIRT1的表達 取適量腦組織勻漿，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，1：3加入，勻漿，12000 r·min-1離心10 min，取上清，根據BCA試劑盒說明書測蛋白濃度。勻漿上清液與上樣緩沖液1：1配比，電泳，轉膜，封閉，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發光劑顯影，采用BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統采集圖像，用Image J2x軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

1.2.7 試劑盒檢測腦組織氧化應激水平 取適量腦組織勻漿，分別采用SOD，MDA，LDH試劑盒測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的水平。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法

用軟件SPSS 21.0對所有實驗數據進行統計分析，組間差異采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗。實驗結果以（均數±標準差）（±s）表示。以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 跳臺實驗及Y迷宮實驗結果

如圖1所示，與假手術組比較，模型組大鼠跳臺實驗犯錯次數顯著增加（P<0.05）；新異臂進入次數顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組大鼠跳臺實驗犯錯次數顯著減少（P<0.05）；新異臂進入次數顯著增加（P<0.05）。

圖1 跳臺實驗犯錯次數（A）和Y迷宮實驗新異臂進入次數（B）統計圖*P<0.05，與假手術組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.1 Statistical chart of the number of errors made in the step-down test(A) and number of new arm entries(B)*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.2 HE染色結果

如圖2所示，假手術組海馬區域組織染色均勻、結構清晰，神經細胞形態正常；模型組海馬區域結構紊亂、間質水腫、胞核出現深染、固縮、碎裂。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組海馬區神經元病變范圍變小，程度減輕。與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率，腦含水率和腦指數均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組大鼠腦梗死率，腦含水率和腦指數均顯著降低（P<0.05）。

圖2 HE染色觀察腦組織病理損傷（A）及腦梗死率（B）、腦指數（C）、腦含水量（D）統計圖*P<0.05，與假手術組相比 #P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.2 Statistical chart of pathological damage of brain tissue(A),cerebral infarction rate(B),brain index(C),brain water content(D),detected by HEstaining*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.3 柴胡皂苷A對腦缺血再灌注大鼠神經元凋亡的影響

如圖3所示，尼氏小體染色結果顯示，假手術組海馬區域組織結構清晰，神經細胞形態正常；腦損傷模型組海馬區域結構紊亂、神經細胞數量減少、細胞核碎裂、溶解及尼氏小體崩解及丟失。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組海馬區神經元損傷程度減輕。免疫印跡結果顯示，與假手術組比較，模型組Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3 和 Cleaved caspase9/caspase9的比值均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3和Cleaved caspase9/caspase9的比值顯著降低（P<0.05）。

圖3 柴胡皂苷A對腦缺血再灌注大鼠神經元凋亡的影響A：尼氏小體染色檢測神經元凋亡B：蛋白印跡檢測Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3/caspase3和Cleaved caspase9/caspase9表達水平*P<0.05，與假手術組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.3 Effect of different concentrationsof saikosaponin A on neuronal apoptosisin ratswith cerebral ischemia-reperfusion A:The neuron apoptosis was detected by Nissl body staining;B:The expression levels of Bax/Bcl-2,Cleared caspase3/caspase3 and Cleared caspase9/caspase9 weredetected by Western blotting;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.4 柴胡皂苷A對腦缺血再灌注大鼠氧化應激的影響

如圖4所示，與假手術組比較，模型組SOD活性顯著降低（P<0.05）；MDA和LDH的含量均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組10 mg/kg組SOD活性顯著升高（P<0.05），MDA和LDH的含量均顯著降低（P<0.05）。

圖4 柴胡皂苷A對腦缺血再灌注大鼠氧化應激的影響A：SOD活性統計圖B：MDA含量統計圖C：LDH含量統計圖 *P<0.05，與假手術組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.4 Effects of different concentrations of saikosaponin A on oxidative stress in rats with cerebral ischemiareperfusion A:Statistical chart of SOD activity;B:Statistical chart of MDA content;C:Statistical chart of LDH content;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

2.5 柴胡皂苷A對SIRT1表達的影響

如圖5所示，與假手術組比較，模型組SIRT1 mRNA表達和SIRT1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，柴胡皂苷A 5 mg/kg組、柴胡皂苷A 10 mg/kg組和尼莫地平1 mg/kg組SIRT1 mRNA表達和SIRT1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。

圖5 柴胡皂苷A對SIRT1表達的影響A：RT-qPCR檢測SIRT1 mRNA表達統計圖B：蛋白印跡檢測SIRT1蛋白表達*P<0.05，與假手術組相比#P<0.05，與I/R組相比n＝9Fig.5 Effect of different concentrations of saikosaponin A on the expression of SIRT1 A:Statistical chart of SIRT1 mRNA expression detected by RT-qPCR;B:SIRT1 protein expression detected by Western blot;*P<0.05 vs Sham group;#P<0.05 vs I/Rgroup;n=9

3 討論

由腦缺血引起的腦組織損傷的病理機制很復雜，包括炎癥反應，氧化應激，細胞凋亡，能量代謝，鈣超載和其他因素[11]。缺血區域的血流再灌注會導致嚴重的腦損傷和相關功能障礙，尤其是神經元和神經膠質細胞的損傷[12]。柴胡皂苷A是從柴胡中提取的三萜皂苷，具有廣泛的藥理活性[13]。本研究結果顯示，經柴胡皂苷A處理后，大鼠跳臺實驗犯錯次數減少；新異臂進入次數增加，海馬神經元損傷減輕，腦梗死率，腦含水率和腦指數均降低，提示柴胡皂苷A能減緩腦缺血再灌注引起的腦損傷，起到腦保護的作用。

凋亡信號傳導途徑由胱天蛋白酶介導，其中，caspase-3和caspase-9是凋亡過程中的關鍵介體。凋亡途徑可以通過caspase-9啟動，并通過切割下游執行者caspase-3觸發凋亡[14,15]。作為Bcl-2家族的2種典型蛋白質，Bcl-2和Bax在caspase依賴性細胞凋亡中起關鍵作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，主要位于細胞核和線粒體膜上，而促進凋亡的家族成員Bax主要位于細胞質中。Bcl-2在抑制Bax誘導的caspase依賴性凋亡方面具有很強的抗凋亡作用。因此，高比例的Bcl-2/Bax被認為具有抗凋亡的作用[16]。研究發現，柴胡皂苷A能夠通過調節Bcl-2家族介導caspase-3依賴性和獨立性的凋亡，導致線粒體功能障礙和凋亡因子的釋放[17]。本研究結果顯示，經柴胡皂苷A處理后，Bax/Bcl-2，Cleaved caspase3/caspase3 和 Cleaved caspase9/caspase9蛋白表達水平的比值降低，提示柴胡皂苷A能夠抑制腦缺血再灌注引起的神經元凋亡。

氧化應激可與細胞膜、脂質和蛋白質等細胞的幾種基本成分相互作用[18]。據報道，在炎癥條件下，脂質氧化的標志物MDA的濃度非常高，其濃度與氧化負荷的程度有關[19]。研究發現，柴胡皂苷A處理能提高抗氧化酶（Nrf2，HO-1，SOD，GSH，GST和過氧化氫酶）活性，降低MDA含量，因此證實柴胡皂苷A不僅通過抑制活性氧的產生來提高抗氧化酶的水平，還可通過抑制脂質過氧化來增強其抗氧化潛能[20]。本研究結果顯示，柴胡皂苷A處理后，SOD活性升高，MDA和LDH的含量降低，提示柴胡皂苷A可緩解腦缺血再灌注引起的氧化應激。

沉默信息調節器1（silent information regulator 1，SIRT1）有助于細胞調節。SIRT1是神經系統疾病的保護因子，可以調節基因表達并適應細胞代謝[21]。SIRT1促進自噬并減少缺氧誘導的凋亡，從而保護心肌細胞免受缺氧應激的影響[22]。研究發現，上調SIRT1可以促進自噬并抑制體外細胞凋亡，因此對氧葡萄糖剝奪/再灌注誘導的損傷具有潛在的神經保護作用[23]。本研究結果顯示，經柴胡皂苷A處理后，SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均升高，提示柴胡皂苷A對腦缺血再灌注引起的神經元損傷緩解作用與SIRT1上調有關。

綜上所述，胡皂苷A能緩解缺血再灌注大鼠海馬神經元損傷和氧化應激，其機制與SIRT1上調有關。本實驗可為防治缺血性腦血管疾病的臨床應用和實驗研究提供依據和思路。