厄貝沙坦對高血壓合并2型糖尿病大鼠胰島素抵抗IRS-1/PI3K/GLUT4信號通路的影響

劉莉， 羅鵬， 周田田， 李燕， 謝紅艷， 呂德

1.攀鋼集團總醫院內分泌科，四川 攀枝花 617000； 2.成都中醫藥大學附屬醫院基地辦公室，成都 610075 3.成都中醫藥大學附屬醫院內分泌科，成都 610075

高血壓、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為慢性代謝性疾病是影響人類壽命的兩大重要風險因素。高血壓是T2DM的常見并發癥，在T2DM患者中伴有高血壓患者高達40%左右，由于其高發病率和高死亡率已經成為世界范圍內的健康問題[1]。研究發現胰島素抵抗（insulin resistance，IR）與多種代謝性疾病有關[2]，IR可能是高血壓與T2DM的共同致病因素，因此有效調控IR，是防治高血壓與T2DM的重要手段之一。已有研究表明[3]，IR與胰島素受體底物家族失調，進而導致葡萄糖轉運蛋白表達異常有著密切的關系。其中胰島素受體基因-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）是胰島素受體底物家族中的一員，在骨骼肌中高表達。而骨骼肌中IRS-1異常磷酸化或表達減少會造成胰島素代謝調節的主要信號通路IRS-1/磷脂酰肌醇（-3）激酶（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory，PI3K）/葡萄糖轉運蛋白4（glucose transport protein GLUT4，GLUT4）通路受損，最終導致IR[4]。厄貝沙坦是一種常用降壓藥物，研究表明厄貝沙坦能夠減輕胰島素抵抗作用，而其機制尚不明確[5]。本研究通過觀察厄貝沙坦對高血壓合并T2DM大鼠的影響，探討該藥是否通過調節IRS-1/PI3K/GLUT4信號通路對胰島素抵抗大鼠發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性自發性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）30只和與SHR遺傳背景相同的Wistar-Kyoto（WKY）大鼠10只購自上海萊克公司，體重為（200±2）g，飼養于本院動物實驗中心，飼養室保持良好通風，飼養環境溫度為（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h循環光照。正常飼養1周以適應環境，第2周開始進行實驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司），厄貝沙坦片（批號：J20110026，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司），馬來酸羅格列酮片（文迪雅）（批號：H20020475，葛蘭素史克公司），羅氏活力型血糖試紙（德國Roche Diagnostics GmbH公司），胰島素試劑盒、游離脂肪酸試劑盒（美國Cayman公司），包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）購自北京普利萊基因技術有限公司，全蛋白抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），Western blot試劑盒（美國BD公司），IRS-1、PI3Kp85、AKT、p-AKT及GLUT4抗體（美國Abcam公司）。RBP-IB型血壓計（北京中日友好臨床醫學研究所）；血糖儀（美國Jhonson醫療器械有限公司）；臺式離心機（北京醫用離心機廠）；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡（日本三菱公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及取樣 根據Wong等人[6]的方法對SHR大鼠建立T2DM模型，SHR大鼠高糖髙脂飼料喂養，2周后，計算穩態模型評價胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR＝空腹血清胰島素濃度（μU/ml）×空腹血漿葡萄糖濃度（mmol/L）/22.5。成功誘導出胰島素抵抗（HOMA.IR≥3.8），隨后禁食12 h，予以腹腔一次性注射STZ，注射劑量為35 mg/kg，1周后空腹12 h，取鼠尾血，檢測血糖水平，血糖≥16.7 mmol/L表明T2DM造模成功。取10只WKY大鼠作為對照組給予普通飼料喂養并注射生理鹽水。造模成功后將30只SHR合并T2DM大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦低、高劑量組，每組10只；厄貝沙坦低、高劑量組每日分別按30、60 mg/kg劑量灌服[7]，對照組和模型組灌服等量生理鹽水，連續5周，觀察攝食量及飲水量的變化，并于每周末稱量大鼠體重。造模后第5周，禁食8 h，尾部取血備用，處死后取骨骼肌組織，一部分固定于4%甲醛，一部分于-80℃保存。

1.2.2 大鼠SBP、FBG、FINS檢測及HOMA-IR計算分別于造模后、處死前采取套尾法測量大鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP），取大鼠尾部血，使用快速血糖儀，采血前將血糖試紙插入儀器內，在尾靜脈處滴血測空腹血糖值；取各組大鼠眼眶血，3000 rpm離心15 min，取血清為待測樣本。ELISA試劑盒測定血清中FINS含量，具體操作依照試劑盒說明書進行。反應中止后，采用酶標儀測量450 nm處的OD值，計算大鼠胰島素濃度。根據公式HOMA-IR＝（FBG×FINS）/22.5計算HOMA-IR[8]。

1.2.3 HE染色檢測大鼠骨骼肌組織冰凍切片 各組大鼠骨骼肌組織在4%多聚甲醛溶液中4℃固定2 h，包埋劑（optimal cutting temperaturecompound，OCT）包埋，切成4μm的切片。然后依次脫蠟、水化，進行HE染色、脫水、二甲苯充分浸泡2 h直至透明后干燥。用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態并拍攝。

1.2.4 免疫熒光檢測大鼠骨骼肌組織GLUT4的表達取各組大鼠骨骼肌冰凍切片用5%BSA的封閉液室溫封閉1 h，將GLUT4一抗以1：100比例稀釋并滴加在切片上，室溫孵育2 h，PBS沖洗干凈，加稀釋好的熒光標記的二抗于37℃避光作用1 h，用稀釋好的DAPI染細胞核，封片并置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot檢測大鼠骨骼肌組織IRS-1、PI3Kp85、AKT及p-AKT蛋白表達 分別收集各組樣本，用總蛋白提取試劑盒分別提取組織及細胞中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉至PVDF膜，加含有5%BSA的封閉液室溫下封閉2 h。加入IRS-1（1：1000）、PI3Kp85（1：1000）、AKT（1：1000）及磷酸化AKT（p-AKT）（1：1000）一抗于4℃封閉過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入標記HRP的二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.3 統計學分析

數據統計采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 厄貝沙坦對大鼠飲食、飲水及體重的影響

經高糖高脂飲食聯合STZ造模后，大鼠先后出現飲食、飲水增加現象；在給與厄貝沙坦治療后，隨時間增加，不同劑量組大鼠均比模型組飲食、飲水量減少。分別于造模后的5個周末稱量大鼠體重，結果如圖1所示，對照組大鼠在實驗觀察期內體重持續增加；與對照組相比，模型組大鼠體重在造模后1至5周持續下降，差異具有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦各組大鼠體重逐漸增加，差異具有統計學意義（P<0.05），厄貝沙坦高劑量組大鼠體重增加更加明顯，差異具有統計學意義（P<0.05）。

圖1 厄貝沙坦對大鼠體重的影響（n＝10）*P<0.05，與對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.1 Effect of Irbesartan on body weight in rats（n=10）*P<0.05 vscontrol group,#P<0.05 vsmodel group

2.2 厄貝沙坦對大鼠SBP、FBG、FINS及HOMA-IR的影響

造模后，與對照組相比，其余各組大鼠SBP、FBG、FINS及HOMA-IR顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.01）；處死前，與對照組相比，模型組SBP、FBG、FINS及HOMA-IR明顯升高（P<0.01），與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠以上指標均減少（P<0.05，P<0.01）。另外，與造模后相比，厄貝沙坦低、高劑量組在處死前SBP、FBG、FINS及HOMA-IR均下降（P<0.05），而對照組和模型組差異不顯著（P>0.05），見圖2。

圖2 厄貝沙坦對大鼠FBG、SBP、FINS及HOMA-IR的影響（n＝10）**P<0.01，與對照組比較#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較ΔP<0.05，與造模后第1周比較Fig.2 Influence of Irbesartan on rat FBG,SBP，FINSand HOMA-IR（n=10）**P<0.01 vscontrol group,#P<0.05,##P<0.01 vsmodel group,ΔP<0.05 vsafter modeling at 1 week

2.3 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織的影響

結果如圖3所示，對照組大鼠骨骼肌肌纖維排列正常，細胞核排列有序，未見炎性浸潤；而模型組大鼠骨骼肌肌纖維排列紊亂，間隙增加，有波浪樣改變，細胞核異位；與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組肌纖維排列有不同程度的恢復。

圖3 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織的影響 A：對照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組Fig.3 Effect of Irbesartan on skeletal muscle tissue of rats A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dose group;D:Irbesartan high-dosegroup

2.4 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織中GLUT4表達的影響

為進一步驗證厄貝沙坦是否調節IRS-1/PI3K通路下游葡萄糖轉運相關的關鍵蛋白GLUT4的表達，采用免疫熒光檢測各組大鼠骨骼肌組織中GLUT4的表達。結果如圖4所示，GLUT4主要定位于細胞膜，與對照組相比，模型組中GLUT4的表達明顯減少；與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠骨骼肌組織中GLUT4表達均增加（P<0.05）。

圖4 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織GLUT4表達的影響（n=10）A：對照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組；E:各組GLUT4相對表達量統計圖*P<0.05，與對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.4 Effect of Irbesartan on GLUT4 expression in skeletal muscletissueof rats（n=10）A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dosegroup;D:Irbesartan high-dose group;E:Statistical chart of GLUT4 relative expression level;*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group

2.5 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織IRS-1及PI3K通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組IRS-1、PI3Kp85及p-AKT的表達明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠IRS-1、PI3Kp85及p-AKT的表達均增多（P<0.05），見圖5。

圖5 厄貝沙坦對大鼠骨骼肌組織IRS-1及PI3K通路相關蛋白表達的影響（n=10）A：對照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組*P<0.05，與對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.5 Effect of Irbesartan on theprotein expression of irS-1 and PI3K pathway in skeletal muscletissuesof rats（n=10）A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dose group;D:Irbesartan high-dose group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs model group

3 討論

高血壓合并T2DM是一種臨床常見疾病類型，其發病機制及病因不明確，嚴重時會引起并發癥威脅患者生命。研究發現，高血壓、糖代謝異常者均存在高胰島素血癥，IR也被認為是高血壓與T2DM主要的共同病理機制之一[9]。IR使機體中胰島素作用的靶組織（肝臟、骨骼肌、脂肪等）對胰島素作用的敏感性降低，無法正常響應胰島素，葡萄糖攝取和處理能力降低，從而導致體內血糖升高，胰島素抵抗還可刺激交感神經系統，心排血量增加，血管收縮或血管張力增加。

厄貝沙坦是一種血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥，能有效阻斷血管緊張肽Ⅱ的血管收縮而起到平穩血壓的作用。有研究發現厄貝沙坦能通過提高大鼠骨骼肌胰島素介導的葡萄糖轉運而增加對胰島素的敏感性[10]；厄貝沙坦能夠促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素的釋放從而有效改善高胰島素血癥[11]。因此本研究通過對SHR合并T2DM大鼠灌服不同劑量的厄貝沙坦，觀察厄貝沙坦對大鼠的保護作用。結果顯示，SHR合并T2DM大鼠給予厄貝沙坦后體重有不同程度的增加，血壓、血糖等指標有不同程度的降低，通過HE染色檢測大鼠骨骼肌的病理變化也發現厄貝沙坦能明顯改善SHR合并T2DM大鼠骨骼肌組織中肌纖維排列紊亂，間隙增加及波浪樣改變的情況，表明厄貝沙坦能夠促進SHR合并T2DM大鼠的恢復。

PI3K/AKT信號通路是胰島素在葡萄糖代謝中的經典途徑[12]。胰島素通過與靶細胞表面的胰島素受體（Insulin receptor，InsR）結合，激活β亞基酪氨酸激酶并與胰島素結合發生自磷酸化，進一步激發細胞內胰島素受體底物IRS家族磷酸化，其中被激活的IRS-1可與PI3K的p85調節亞基結合并使AKT發生磷酸化。GLUT4蛋白是IRS-1/PI3K通路下游葡萄糖轉運相關的關鍵蛋白，主要定位于細胞膜，AKT發生磷酸化后可加速GLUT4從細胞內轉移至細胞膜，與細胞膜融合，增加葡萄糖的攝取[13]。大部分胰島素代謝活動通過PI3K通路激活，而當這條信號通路上的任何一個環節被減弱或抑制后均可能抑制胰島素生理作用進而導致IR。研究顯示通過調節PI3K信號通路可影響T2DM大鼠骨骼肌中葡萄糖的攝取和利用[14]。Abdelmageed等人[15]也表明PI3K/AKT信號通路受損與糖尿病大鼠肝胰島素抵抗密切相關。本研究通過Western blot檢測各組大鼠骨骼肌中IRS-1/PI3Kp85/GLUT4通路蛋白表達，發現與對照組相比，模型組中除AKT無 明 顯 變 化，IRS-1、PI3Kp85、p-AKT及GLUT4表達均明顯下降，而與模型組相比，厄貝沙坦各組IRS-1、PI3Kp85、p-AKT及GLUT4表達均有不同程度的上升。提示厄貝沙坦能夠通過IRS-1/PI3K/GLUT4信號通路抑制SHR合并T2DM大鼠IR，調節體內胰島素及葡萄糖利用，進而發揮對SHR合并T2DM大鼠的保護作用。

綜上所述，厄貝沙坦可通過促進IRS-1/PI3K/GLUT4信號通路對SHR合并T2DM大鼠發揮保護作用，本研究能夠為臨床治療提供一定的理論依據。