山莨菪堿緩解幼齡鼠缺氧缺血性腦組織形態和功能損傷

朱渝， 魏靜， 吳鵬程， 袁瀟， 周振華， 李敏

1.重慶市第七人民醫院神經內科，重慶 400054； 2.重慶醫科大學附屬永川醫院神經內科，重慶 402160；3.陸軍軍醫大學新橋醫院神經內科，重慶 400038

缺氧缺血性腦病于新生兒較多發，臨床表現主要有興奮或遲鈍，嚴重時會發生肌張力松軟甚至昏迷，該病常伴隨學習困難、癲癇、腦癱等后遺癥，嚴重影響人類生命健康和生活質量[1～3]。研究表明，缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）發病機制主要有腦血流改變、腦血管自主調節功能障礙和腦組織代謝改變等[4]。目前，臨床治療以營養腦細胞藥物配合康復訓練為主，但治療效果不確切，因此，探尋新的治療藥物至關重要[5]。山茛菪堿是從茄科植物唐古特山茛菪中分離得出的生物堿，具有外周抗膽堿、改善微循環、抑制血小板聚集、血栓形成、腦梗死、癱瘓、腦血管痙攣、血管神經性頭痛、閉塞性血栓性脈管炎等藥理作用[6～8]，但山茛菪堿在缺氧缺血性腦損傷中的研究鮮見報道。本實驗旨在通過建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型，探究山茛菪堿在幼鼠腦組織形態損傷和神經元功能損傷中的調節作用，為其在缺氧缺血性腦病中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠50只，雌雄各半，1～2周齡，體質量12～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2016-0008，使用許可證號SYXK（京）2017-0033。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 山茛菪堿（純度≥98%）購自成都鈉鈳鋰生物公司（CAS17659-49-3），HE染色試劑盒、TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，SOD、MDA、GSH-Px和BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，TRIzol和RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，HRP標記的二抗、cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔來源的單克隆抗體購 自 美 國 Abcam 公 司（ab184787、ab191468、ab182734、ab117115、ab226843、ab256584）。ABI 7500 Real-Time PCR系統購自美國Applied Biosystems公司，脫 色 搖 床（Servicebio，TSY-B），掌 上 離 心 機（Servicebio，MX-F），組織攤片機（浙江金華市科迪儀器設備有限公司），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016），酶 標 儀（Rayto，RT-6100），移 液 槍（Dragon，KE0003087／KA0056573），臺式高速離心機（DRAGONLAB，D3024R），光學顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100）。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組、建模及取材 將50只幼齡鼠隨機分為健康對照組、模型組、模型+2.5 mg/kg山茛菪堿組、模型+5 mg/kg山茛菪堿組、模型+10 mg/kg山茛菪堿組共5組（n＝10）。飼養條件：每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格規范的卡片登記管理，24℃、濕度40%～70%條件下自由攝食飲水飼養，建模前24 h禁食不禁水。模型加藥組分別采用尾靜脈注射2.5、5、10 mg/kg山茛菪堿[9]，健康對照組和模型組注射等量的生理鹽水。6 h后采用Rice-Vannucci法建立HIBD幼齡鼠模型[10]：取模型組和模型加藥組大鼠，用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后置于手術臺上固定，手術過程控制為無菌環境，頸部消毒，頸部正中切口，剝離頸總動脈，右側頸總動脈雙結扎后切斷，手術后將大鼠置于缺氧倉內（倉內環境：8%O2、92%N2、37℃），2 h后進行自然通氣。健康對照組只切口并縫合，不結扎頸總動脈和缺氧處理。參照Longa法評價大鼠神經功能損傷[11]，48 h后斷頭處死大鼠并取腦，部分腦組織用4%多聚甲醛固定，剩余腦組織凍存用于分子實驗。

1.2.2 檢測腦指數和腦含水率 采用干濕重法測定各組大鼠腦組織腦含水率和腦指數。斷頭法處死大鼠并取腦，剝去腦膜、小腦和腦干，用0.1 mmol磷酸鹽緩沖清洗，濾紙吸干并稱取腦質量[12]。取左腦并稱取濕質量；隨后置于70℃烘箱中干燥24 h，取出并稱取其干質量，計算腦含水率、腦指數。腦含水率（%）＝（左腦濕質量-左腦干質量）/左腦濕質量×100%；腦指數（%）＝腦質量/體質量×100%。

1.2.3 HE染色觀察腦組織病理損傷 取4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織，石蠟包埋切片，切片厚度為3 μm，將切片浸入二甲苯和濃度梯度無水乙醇中60 min進行脫蠟水洗，然后進行蘇木精-伊紅染色，再將切片放入無水乙醇和二甲苯中透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察組織病理損傷形態學變化并拍照記錄。細胞核被染成藍色，細胞質被染成淡紅色或紫色。

1.2.4 TUNEL染色觀察腦海馬神經元周圍組織細胞凋亡 取各組大鼠海馬神經元周圍組織于4%多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后進行脫水、浸蠟和包埋,嚴格按照TUNEL試劑盒操作說明書進行染色。陽性細胞即凋亡細胞被染成棕黃色或褐色，非凋亡細胞呈藍色。1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平 取出預先凍存的大鼠腦組織，室溫自然解凍后用手術剪將組織剪切成小塊放入研磨儀中研磨均勻，4℃、10000 r/min離心10 min棄上清，用BCA試劑盒測定蛋白總濃度，每孔上樣20μg，經SDS-PAGE電泳分離、轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔來源的單克隆一抗（1：500），4℃搖床孵育過夜，次日加入HRP標記的對應二抗（1：4000），室溫下搖床孵育2 h后，用ECL化學發光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片整理去色并存檔，分析計算各組小鼠蛋白相對表達量。獨立重復實驗3次取平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測BDNF和NGF表達水平 取出預先凍存的大鼠腦組織約80 mg，溫室解凍組織后置于超聲研磨均勻。4℃、12000 r/min離心15 min，用TRlzol試劑盒提取總RNA并測定RNA濃度和純度。按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，按RT-PCR試劑盒操作說明配制反應體系。在PCR擴增儀上進行擴增（擴增條件：保持步驟96℃15 s，40個周期，95℃10 s和60℃30 s），以目的基因和內參比值表示mRNA表達水平，采用2-△△CT法分析結果。獨立重復實驗3次，取平均值。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：BDNF（390bp）5'-CTTTCATGCAACTGAAGTATGAAA-3'，5'-CCGAC GTGGAGAGCTGAGCGTGTGT-3'。NGF（119bp）5'-CTCTGTCCCTGAAGCCCACTG-3'，5'-TGTTGCGG GTCTGCCCTGTC-3'。β-actin（76bp）5'-ACCCGCG AGTACAACCTTCTT-3'，5'-TATCGTCATCCATGGC GAACT-3'。

1.2.7 試劑盒檢測SOD、MDA和GSH含量 取4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織，按試劑盒說明進行測定SOD、MDA和GSH-Px含量，4℃、3000 r/min離心15 min，取上清，在96孔板反應孔中加入標準品和待測樣本100μl，設置3個復孔。在空白對照孔中加入100μl稀釋液，然后在37℃孵育箱中孵育30 min，最后加入酶標抗體進行酶聯免疫反應，終止反應后將96孔板放入酶標儀上進行檢測?？瞻卓渍{零，測定450 nm處各孔的OD值。

1.3 統計分析

使用SPSS 17.0和GraphPad prism 5.0軟件分析，正態分布的計量資料表示為均數±標準差（Mean±SD）。多組數據比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山茛菪堿對HIBD幼齡鼠腦指數和腦含水率的影響

與健康對照組比較，模型組幼齡鼠腦指數和腦含水率升高（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦指數和腦含水率均無明顯差異（P＞0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組腦指數和腦含水率降低（P<0.05），見圖1。說明山茛菪堿能夠緩解HIBD幼齡鼠腦損傷。

圖1 腦指數（I）和腦含水率（II）檢測統計圖A：健康對照組B：模型組C：模型+2.5 mg/kg山茛菪堿組D：模型+5 mg/kg山茛菪堿組E：模型+10 mg/kg山茛菪堿組（圖2～5為相同分組）*P<0.05，與健康對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.1 Statistical diagram of brain index(I)and brain water content(II)A:healthy control group;B:model group;C:model+2.5 mg/kg anisodamine group;D:model+5 mg/kg anisodamine group; E: model + 10 mg/kg anisodamine group；(Thesamegroup A,B,C,D asin Fig.2～Fig.5)*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.2 山茛菪堿對HIBD幼齡鼠腦組織病理損傷的影響

HE染色觀察各組幼齡鼠腦組織病理損傷程度，健康對照組腦組織結構正常，未見病理改變。與健康對照組比較，模型組幼齡鼠腦組織結構紊亂，可見胞質空泡化，胞核固縮破裂以及大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織結構紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，5 mg/kg山茛菪堿組腦組織結構明顯改善，可見少量炎性細胞浸潤，10 mg/kg山茛菪堿組腦組織結構趨于正常，未見炎性細胞浸潤，見圖2。結果說明，山茛菪堿能改善HIBD幼齡鼠腦組織病理損傷。

圖2 HE染色觀察各組幼齡鼠腦組織病理損傷程度Fig.2 HEstaining wasused to observethedegreeof pathological damageto thebrain tissueof young ratsin each group

2.3 山茛菪堿對HIBD幼齡鼠腦神經元細胞凋亡形態學影響

TUNEL染色觀察各組幼齡鼠腦神經元細胞凋亡情況及定量分析，健康對照組海馬神經元周圍組織中未見凋亡細胞。與健康對照組比較，模型組幼齡鼠腦海馬神經元周圍組織中可見大量褐色或棕黃色陽性細胞，即細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠海馬神經元周圍組織中仍可見大量凋亡細胞且細胞凋亡率無明顯差異，5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組海馬神經元周圍組織中僅見極少細胞凋亡，凋亡細胞率顯著降低（P<0.05），見圖3。說明山茛菪堿能緩解HIBD幼齡鼠神經元細胞凋亡。

圖3 TUNEL染色觀察各組幼齡鼠神經元細胞凋亡Ⅰ:TUNEL染色檢測各組幼齡鼠腦神經元細胞凋亡情況Ⅱ:半定量分析各組幼齡鼠腦神經元細胞細胞凋亡率*P<0.05，與健康對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.3 TUNEL staining was used to observe the neuronal apoptosis of young rats in each groupⅠ:TUNEL staining was used to detect the apoptosis of brain neurons of young rats in each group；Ⅱ:Semi-quantitative analysis of apoptosis rate of brain neuron cellsof young ratsin each group *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vsmodel group

2.4山茛菪堿對HIBD幼齡鼠腦組織中凋亡蛋白表達水平的影響

與健康對照組比較，模型組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平均顯著上調（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯著下調（P<0.05），見圖4。說明山茛菪堿能緩解HIBD幼齡鼠腦組織細胞凋亡。

圖4 Western blot檢測各組幼齡鼠腦組織中凋亡蛋白表達水平Ⅰ:Western blot檢測各組幼齡鼠腦組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平 Ⅱ:半定量分析各組幼齡鼠腦組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平*P＜0.05，與健康對照組比較，#P＜0.05，與模型組比較Fig.4 Western blot was used to detect the expression level of apoptotic protein in the brain tissue of young ratsin each groupⅠ:Western blot was used to detect the protein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in the brain tissuesof young ratsin each group；Ⅱ:Semi-quantitativeanalysisof theprotein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in thebrain tissues of young ratsin each group

2.5 山茛菪堿對HIBD幼齡鼠神經功能的影響

與健康對照組比較，模型組幼齡鼠神經功能損傷評分顯著增高[11]，腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經營養因子（nerve growth factor，NGF）蛋白及mRNA表達水平降低（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠神經功能損傷評分、BDNF和NGF均無明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組神經功能損傷評分顯著降低，BDNF和NGF表達水平顯著上調（P<0.05），見圖5。結果說明，山茛菪堿能夠緩解HIBD幼齡鼠神經功能損傷。

圖5 各組幼齡鼠神經功能檢測I：神經功能損傷評分II：BDNF和NGFmRNA表達水平III、IV：BDNF和NGF蛋白表達水平*P<0.05，與健康對照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.5 Thenerve function of young ratswastested in each group I:Nerve function damage score;II:BDNF and NGF mRNA expression level;III、IV:BDNF and NGF protein expression level *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.6 山茛菪堿對HIBD幼齡鼠氧化應激水平的影響

與健康對照組比較，模型組幼齡鼠腦組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量顯著升高，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）含量降低，P<0.05。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量均無明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組腦組織中MDA含量降低，SOD和GSH-Px含量增高（P<0.05），見表1。說明山茛菪堿能夠減輕HIBD幼齡鼠腦組織中氧化應激水平。

表1 各組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

表1 各組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

*P<0.05，與健康對照組比較#P<0.05，與模型組比較*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

GSH-px（U/ml）97.18±9.75 40.21±5.43*50.32±6.57 69.06±8.19#96.84±10.26#組別Group Control HIBD HIBD+Anis藥物劑量（mg/kg）Dose(mg/kg)2.5 5.0 10.0 MDA（mmol/ml）2.21±0.34 5.37±0.46*5.33±0.51 3.59±0.38#2.66±0.34#SOD（U/ml）4.43±0.47 2.08±0.38*2.14±0.21 3.16±0.35#4.29±0.47#

3 討論

缺氧缺血性腦損傷發生時，會出現腦組織水腫、選擇性神經元壞死、基底神經節大理石樣變性、大腦矢狀旁區神經元損傷和腦室周圍白質轉化等[13～15]。本實驗通過建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型，觀察各組幼鼠腦指數和腦含水率及病理損傷程度，結果發現，經山茛菪堿藥物治療后，幼鼠缺氧缺血性腦損傷程度明顯得到改善，腦指數和腦含水率顯著降低。結果提示，山茛菪堿在缺氧缺血性腦損傷幼鼠中具有調節作用。為明確山茛菪堿改善幼鼠缺氧缺血性腦損傷的作用機制，還檢測了各組幼鼠腦海馬神經元周圍組織細胞凋亡水平、腦組織凋亡蛋白和氧化應激水平及神經功能。

海馬神經元周圍組織細胞凋亡和腦組織細胞凋亡是缺氧缺血性腦損傷的主要病因。Bax、Bcl-2、caspase-9和caspase-3是細胞凋亡過程中重要的調節蛋白，凋亡發生時，凋亡起始蛋白caspase-9誘導并激活下游的凋亡執行蛋白caspase-3，活化的caspase-9和caspase-3進一步啟動凋亡級聯反應，促使細胞發生DNA裂解及凋亡過程。而Bax和Bcl-2分別為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白并在細胞凋亡過程中發揮作用，Bax/Bcl-2比值通常決定著細胞凋亡水平[16～18]。本研究結果顯示，經山茛菪堿藥物治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠海馬神經元周圍組織和腦組織中凋亡細胞顯著減少，Bax/Bcl-2、caspase-9和caspase-3蛋白表達水平顯著降低，表明，山茛菪堿通過抑制腦海馬神經元周圍組織細胞和腦組織細胞凋亡緩解幼鼠缺血缺血性腦損傷。

神經元細胞由細胞體和細胞突起構成，主要功能是通過接受、整合、傳導和輸出信息實現信息交換。腦缺氧缺血時，腦神經元受損，機體無法完成正常的信息交換導致神經功能損傷。神經功能受損進一步導致中樞神經系統和周圍神經系統不能對生理功能活動進行正常調節，促使繼發性腦損傷。腦前額葉腦源性神經營養因子（BDNF）是一種具有神經營養作用的蛋白質，主要在中樞神經系統內表達，通過與酪氨酸激酶B結合而發揮作用，從而促進神經細胞生存和神經發生。神經生長因子（NGF）是最早發現的神經營養因子，廣泛存在于各組織器官中，能促進中樞神經和外周神經元的生長、發育、分化、成熟，能夠維持神經系統的正常功能，加快神經系統損傷后的修復等[19]。研究表明，腦內移植BDNF和NGF有利于改善缺氧缺血性腦損傷新生大鼠運動和行為記憶能力[20]。本研究結果顯示，經山茛菪堿治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠神經功能顯著好轉，BDNF和NGF表達水平顯著增高，提示山茛菪堿對缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦神經功能具有保護作用。

氧化應激與多種生理病理過程密切聯系，正常情況下，機體內氧化與抗氧化處于動態平衡，缺氧缺血性腦損傷發生時，缺氧導致腦組織中產生的大量氧自由基不能被清除，氧化與抗氧化動態平衡被打破，從而損壞腦組織正常功能，加重腦組織損傷。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產物，過量的MDA能夠促進膜損傷和氧化過程，通常MDA含量反映脂質過氧化程度及細胞損傷程度。超氧化物歧化酶（SOD）則與之相反，SOD是一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是一種重要的過氧化物分解酶，能夠保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的損害[21～23]。本實驗結果顯示，經山茛菪堿治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織中MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px含量顯著升高。結合前期結果可知，山茛菪堿通過調節缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織氧化應激緩解幼鼠腦損傷。

綜上所述，山茛菪堿能夠緩解缺氧缺血性腦損傷幼齡鼠腦組織形態和神經功能損傷，其作用機制與抑制腦細胞凋亡，促進神經功能因子表達，調節氧化應激水平有關。