造紙法再造煙葉廢水中微生物多樣性分析

馮文超， 李 軍， 劉永龍， 許炎坤， 李 東， 陶宏兵， 謝小保

1.廣東迪美生物技術有限公司，廣東 廣州 510063; 2.中山大學化學工程與技術學院，廣東 珠海 519082;3.廣東省防霉抗菌工程技術研究中心，廣東 廣州 510070;4.廣東省科學院微生物研究所 華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070

造紙法再造煙葉廢水含豐富的有機物種類，如芳香酸和環己羧酸，含氮雜環(包括尼古丁)、芳香烴和酯類[1, 2]。廢水處理過程中，各種主要污染物降解及代謝過程復雜。膜生物反應器(MBR)/反滲透(RO)組合系統是近年來廣受關注[3-5]的用于處理再造煙葉廢水的新技術，通常與其他技術聯用[6-9]，可以更高效、環保的去處如微粒、高濃度有機物、有毒污染物和病原微生物[10-12]等污染物。

MBR膜表面可聚集大量微生物種群，在廢水通過膜過濾之前完全清除污染物。另外，由于膜的篩分作用，保留了分子量大于膜分子量截留值的污染物，從而使其與MBR內部的降解微生物接觸以使其完全降解[10]。微生物種群多樣性是影響MBR處理效果的重要因素之一，但相關研究目前少見報道。

本文采用16S rRNA基因高通量測序對云南某造紙法再造煙葉生產廢水處理系統活性污泥中微生物多樣性進行分析，考察了再造煙葉廢水處理過程中的活性污泥中細菌的多樣性，活性污泥細菌多樣性和群落結構復雜性，探究其在降解有機污染物和無機污染物以及降低廢水水質色度方面的活性和廣譜性，以確保造紙法再造煙葉生產廢水處理效果的穩定性和高效性，并為后續功能微生物的篩選和MBR/RO工藝的開發提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

云南某造紙法再造煙葉生產廢水處理系統曝氣池中活性污泥；總DNA提取試劑盒(DNA Isolation kit，MO BIO PowerSoil，美國)；DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep，研卉生物，上海)；載體連接試劑盒(pSURE-T，研謹生物，上海)；凝膠成像儀(170-8170，Bio-Rad，美國)；X射線熒光光譜儀(PW4400/40，Bruker，德國)；變性梯度凝膠電泳系統(DCodeTM System，Bio-Rad，英國)。

1.2 方法

1.2.1DNA提取

樣品的總DNA通過細菌總DNA提取試劑盒提取，DNA質量用瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用通用引物16S rRNA基因序列對總DNA擴增，PCR產物通過DNA凝膠回收試劑盒純化[13]。

1.2.216S rRNA基因文庫構建

經過感受態細胞轉化和載體片段連接，培養出可見單克隆菌落，之后放置在4 ℃冰箱30 min顯色，挑取白色菌斑的陽性克隆，用載體連接試劑盒轉接至含氨芐抗生素的LB瓊脂平板(Lysogeny Broth)中，培養作為一個文庫。之后經過菌落PCR擴增篩選，分析電泳結果。采用Neighbor-Joining法對樣品進行微生物系統發育分析，使用QIIME程序構建最終的系統發育樹。

2 結果與討論

2.1 樣品中總DNA提取和PCR(聚合酶鏈式反應)產物純化

如圖1所示，電泳條帶長度在5 000 bp～8 000 bp之間，條帶清晰明亮，說明可以用于后續的純化和文庫構建相關實驗。

圖1 污泥樣品總DNA的提取效果檢測

上述樣品中的總DNA擴增采用了通用引物16S rRNA基因序列，PCR產物通過DNA凝膠回收試劑盒純化后，其條帶長度1 500 bp左右，如圖2所示，符合后續構建基因組文庫的要求。

圖2 污泥樣品細菌16S rDNA PCR擴增結果

2.2 16S rRNA基因文庫構建

經過菌落PCR擴增篩選電泳結果如圖3所示，其中條帶清晰明亮，共得到條帶長度約1 500 bp的陽性克隆共91個。

圖3 污泥樣品類群分析

2.3 廢水污泥中微生物多樣性分析

對造紙法再造煙葉廢水污泥菌群文庫中的78個陽性克隆測序，得到60個OTU(operational taxonomic units操作分類單元)。樣品中的微生物多樣性分析結果如表1。樣品中香農-威納指數(Shannon-Wiener Index)為3.956 547，說明群落結構復雜，在文庫測序中條帶所含有的信息量大。辛普森多樣性指數(Simpson Index)達到了0.976 2186，接近1，說明群落中細菌種類多，且個體分布均勻。菌種豐富度指數(Chao-1)為235，表明樣品中微生物種群豐度和多樣性很高。總之，活性污泥中的微生物群落種群豐富、結構復雜、多樣性較高，且分布均勻，為廢水處理的持續穩定運行發揮了重要作用。但由于生物總量較低，僅有6.25×107個/mL，且分布過于均勻，也制約了對重要污染物的降解。

表1 污泥樣品微生物群落多樣性分析

同時采用Neighbor-Joining法對樣品進行微生物系統發育分析。使用QIIME程序構建最終的系統發育樹，結果如圖4所示。造紙法再造煙葉廢水污泥樣品的克隆文庫中60個OUT(見圖5)，主要屬于細菌域的7個主要類群，包括變形菌門(Proteobacteria)占總數的48.7%，放線菌門(Actinobacteria)占總數的11.5%，硝化螺旋菌門(Nitrospira)占總數的5.1%，擬桿菌門(Bacteriodetes)占總數的5.1%，綠彎菌門(Chlorobacteria)占到總數的5.1%，未培養菌(Uncultured bacterium)占總數的15.4 %和其他種類占總數的9.0 %。

圖4 污泥樣品細菌系統發育樹

圖5 污泥樣品細菌群落組成

(1)變形菌門

對細菌域中的主要類群進行含量統計和分析，發現污泥樣品中屬于變形菌門(Proteobacteria)的克隆占總數的48.7%，目前文獻報道在多數情況下常規活性污泥菌群中變形菌門(Proteobacteria)為優勢類群。變形菌門在活性污泥群落中成為優勢類群，主要原因在于環境中這一門中的微生物存在的數量和種類占有絕對優勢。

變形菌門細胞參與了各類活性污泥中大多數化合物的降解代謝，其形態和代謝種類多樣，其外膜主要成分為脂多糖組成，其中有一類獨特的黏細菌，可以聚集形成多細胞的子實體。大多數變形菌門細菌具有營兼性、專性厭氧或異養的生活特性，因此活性污泥中的微生物群落也具備結構多樣和代謝活性復雜多樣性，也因而保證了有機化合物在降解過程中的形成“共代謝”機制，保障了降解的穩定性和徹底性。

同時發現，在克隆文庫中，變形菌門(Proteobacteria)中β-變形菌綱是主要的優勢菌群，占變形菌門的47.4%；其次是α-變形菌綱，占變形菌門的36.8%，δ-變形菌綱和γ-變形菌綱分別占變形菌門的10.5%和5.3%(見圖6)。污泥樣品中的β-變形菌綱不僅在數量上占優勢，而且其中包括的亞硝化單胞菌目和硫桿菌屬也在廢水的脫氮除硫環節起到重要作用，同時其中的微生物在降解有機物、去除營養物質等方面也具有重要作用，是活性污泥中的主要類群之一。α-變形菌綱中的微生物經過Blast比對，序列大多來源于廢水處理廠或活性污泥樣品，比對結果符合煙草廢水污泥樣品的特點。

圖6 污泥樣品中變形菌門各綱分布

(2)放線菌門

放線菌門(Actinobacteria)所包含微生物見表2，數量占廢水處理系統中群落總數的11.5 %，也屬于本次樣品中群落結構分析中的主要類群之一，對有機物的降解去除和降低COD有主要的貢獻。放線菌門中的菌種，在分解酚、吡啶、甘油醇、甾族、芳香族、石蠟等許多種復雜的有機物中都有研究報道，包括類諾卡氏菌(Nocardioidessp.)，一種產丙酸假單胞菌(Propionicimonaspaludicola)等。放線菌門在廢水處理過程中的表曝池和IC池中對污染物降解方面是主要貢獻者之一。

表2 污泥樣品中放線菌門所包含的微生物

(3)硝化螺旋菌門和擬桿菌門

硝化螺旋菌門(Nitrospira)所包含微生物如表3，在污泥樣品中占5.1 %。其中的硝化螺旋菌屬(Nitrospira sp.)作為硝化細菌(Nitrifier)，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。結合煙草廢水污泥文庫β-變形菌門中的亞硝化單胞菌，廢水處理系統可以完成氨氮的去除。

表3 污泥樣品中硝化螺旋菌門、擬桿菌門和綠彎菌門所包含的微生物

文庫中綠彎菌門(Chlorobacteria)中的細菌比對結果顯示，序列來源于活性污泥樣品，而擬桿菌門(Bacteriodetes)中的Flavobacteriumsp.有可能存在于污泥的膨脹過程中，但從該類微生物在群落中的比例來看，其比例較小，在進水水質穩定的情況下，這種情況發生的幾率較小。這一部分中的微生物群落組成較為復雜，有益菌和有害菌同時存在，可以通過生物強化和處理參數的優化，對其中的有害微生物加以抑制，提高有益微生物的存在比例和降解有機/無機污染物的效率，進一步提高出水水質，達到排放標準的目標。

硝化螺旋菌門(Nitrospira)是存在于廢水處理廠和實驗室反應器中主要的亞硝酸氧化菌，在水體中，硝化螺旋菌門對氨氮/硝酸鹽/亞硝酸鹽循環體系至關重要，這同上述菌群分析結果一致。

(4)擬桿菌門

擬桿菌門(Bacteriodetes)在污泥樣品中占5.1%，很多擬桿菌門的種類，如黃桿菌綱(flavobacteria)，在水生環境和食物中均有存在，它們在有機物的降解中貢獻著自己特有的活性，鞘脂桿菌綱重要類群為噬胞菌(Cytophaga)，在海洋細菌中占有較大比例，可以降解纖維素。在造紙法再造煙葉生產廢水中，對于木質素、纖維素等大分子難降解有機物中起主要作用。

(5)綠彎菌門

綠彎菌門(Chloroflexi)又稱作綠非硫細菌，在污泥樣品中占5.1 %，這一類細菌具有綠色的色素，可以通過光合作用產生能量，在廢水處理中的主要作用是光合自養產生能量，在微生物菌群對污染物的“共代謝”過程中起到鏈接上下游反應的作用，所以對于大型表曝池廢水的處理過程具有積極的意義。

(6)其他菌門

除上述主要種群外，還發現了少量的梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)和藍細菌門(Cyanobacterium)，共占文庫的9.0 %，是活性污泥樣品中常見的微生物類群見表4。酸桿菌門中有微生物可以降解脂肪烴類有機物，同時經過分析也可發現有少量的對于有機物降解和COD去除不利的微生物成員的存在，但在有益微生物大量存在和繁殖的情況下，這類有害微生物的影響較小。

表4 污泥樣品中其他菌門所包含的微生物

3 結論

(1)造紙法再造煙葉生產廢水活性污泥中包含變形菌門(48.7%)、放線菌門(11.5%)、硝化螺旋菌門(5.1%)、擬桿菌門(5.1%)、綠彎菌門(5.1%)、未培養菌(15.4 %)和其他種類(9.0 %)等細菌域的7個主要類群。

(2)變形菌門在活性污泥群落中成為優勢類群，變形菌門中β-變形菌綱是主要的優勢菌群，占變形菌門的47.4%，其次是α-變形菌綱，占變形菌門的36.8%。放線菌門所包含微生物數量占廢水處理系統中群落總數的11.5 %，也屬于本次樣品中群落結構分析中的主要類群之一。

(3)活性污泥中微生物中所包含的菌門數，占到了目前細菌域中已經發現的菌門中的80 %，顯示了活性污泥的物種多樣性和群落結構復雜性，從側面也佐證了其在生化降解有機污染物和無機污染物以及降低廢水水質色度方面的獨特活性和廣譜性，為再造煙葉生產廢水處理效果的穩定性和高效性提供了重要的保障。