芪斛楂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

安 巧 馮 敏 肖正會 萬 科 柳小蘭 王海波 王道平*

1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025；4. 葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司，貴州 六盤水 550000

芪斛楂顆粒是葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司的獨家品種，由黃芪、炙甘草、茯苓、石斛、山楂、黨參、陳皮、白術(shù)等11味中藥組成。具有健脾和胃、益氣固表、消食導(dǎo)滯的功效，主要用于改善小兒脾胃氣虛、脾失健運癥引起的厭食、偏食、汗多、大便不調(diào)、易感冒等癥狀。臨床研究發(fā)現(xiàn)，芪斛楂顆粒用于輔助治療小兒急性上呼吸道感染[1]、治療兒童營養(yǎng)不良合并反復(fù)呼吸道感染[2]、治療小兒脾虛型腹瀉[3]、治療小兒厭食[4-5]、嬰兒腹瀉[6]，療效顯著。

芪斛楂顆粒各藥材來源產(chǎn)地較廣，質(zhì)量差異較大。復(fù)方中各處方原藥材需要從源頭進(jìn)行優(yōu)選和控制來保證芪斛楂顆粒優(yōu)質(zhì)有效，因此，在進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究前需對各原料藥品質(zhì)進(jìn)行檢測。目前，芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只對甘草酸銨有含量測定要求，尚未見文獻(xiàn)報道其質(zhì)量控制的方法。處方中11味原料藥材所含化學(xué)成分組成復(fù)雜，個別成分的定性定量分析難以充分反映芪斛楂顆粒中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量。指紋圖譜可較充分的反映出藥物所含各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，可提高中藥復(fù)方質(zhì)量控制[7-9]，并為制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[10]。為更有效的控制制劑質(zhì)量，確保其臨床用藥的安全、有效，本實驗首次采用高效液相色譜法(HPLC)建立芪斛楂顆粒的指紋圖譜，應(yīng)用對照品對其主要特征峰進(jìn)行指認(rèn)，對復(fù)方化學(xué)成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀； KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器；ME104E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；EYELA-N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.1.2 實驗試藥 橙皮苷(批號110721-201316)、甘草苷(批號111610-201607)、甘草酸銨(批號110731-201720)、尿囊素(批號111501-200202)、齊墩果酸(批號110709-201808)、熊果酸(批號110742-201823)、白術(shù)內(nèi)酯I(批號111975-201501)、白術(shù)內(nèi)酯II(批號111976-201501)、白術(shù)內(nèi)酯III(批號111978-201501)、黨參炔苷(批號111732-201607)、黃芪甲苷(批號110781-201717)，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購買自中國食品藥品檢定研究院。茯苓酸(批號PCS-181120)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號PCS-190417)、石斛酚(批號PCS-190616)，購自成都植標(biāo)化純。兒茶素(批號161209)由Chengdu Purechem-Standard Co.，Ltd.提供。

黃芪、山藥、炙甘草、茯苓、石斛、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮、白術(shù)，均由葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司提供；芪斛楂顆粒(樣品批號：20190101、20190102、20190311、20190905、20190906、20190907、20190908、20190909、20190910、20190911)，均由葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司生產(chǎn)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，超純水(由純水/超純水-一體機(jī)制備)，乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 11味處方原藥材有效含量參照文獻(xiàn)[11-17]進(jìn)行

1.2.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18 4.6 mm×250 mm，5μm)；乙腈-水(A∶B)梯度洗脫：0～30 min，10%～40% A，30～50 min，40%～90%；50～60 min，90% A；流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 制備對照品 取甘草苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，以色譜甲醇為溶劑，分別制成含甘草苷、橙皮苷約0.1 mg·mL-1溶液。

1.2.4 制備供試品 取芪斛楂顆粒約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，過濾，取續(xù)濾液25 mL，濃縮至干，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻后用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

1.2.5 單味藥及陰性供試品溶液的制備 稱取黃芪、葛根、陳皮及缺各單味藥材復(fù)方陰性藥材，按照各味藥的處方配比與處方工藝提取制備，并按照1.2.3項下方法制備。

2 結(jié)果

2.1 11味中藥材有效含量測定及品質(zhì)評價 11味處方原料藥材不同批次經(jīng)過檢測，結(jié)果如下：“陳皮20190603，陳皮20190601”中橙皮苷含量較高；“甘草JP-20180709，炙甘草20190101”中甘草苷、甘草酸含量較高；“茯苓JP-20180705，茯苓JP-20180706”中茯苓酸含量較高；“山藥JP-20190501，山藥JP-20190503”中尿囊素含量較高；“木瓜JP-20180803，木瓜飲片20190101”中齊墩果酸和熊果酸含量較高；“白術(shù)JP-20180801，白術(shù)(偏小)”中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的總量較高；“黨參20190601，黨參飲片20190101”中黨參炔苷的含量較高；“黃芪JP-20180704，黃芪JP-20180707”中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷含量較高；“山楂JP-20180701，山楂JP-20180803”中枸櫞酸含量較高；“麥芽20190502，麥芽20190503”中兒茶素含量較高；“流蘇石斛JP-20180701，流蘇石斛JP-20180702”中石斛酚含量較高。如圖1所示。

圖1 11味中藥材不同批次含量測定

由此可見，每味藥材不同批次樣品中有效成分的含量存在顯著差異。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 重復(fù)性試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法，平行制備供試品溶液5份，按1.2.2項下色譜條件，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均低于0.4 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，分別在0 h、2.5 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、48 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰的相對保留時間RSD均小于0.5 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %，供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗 取芪斛楂顆粒(批號：20190311)，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計算16個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均小于0.6 %，相對峰面積RSD均低于3.0 %。

2.3 芪斛楂顆粒液相指紋圖譜建立及特征峰標(biāo)定

2.3.1 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的建立及評價 取10批芪斛楂顆粒樣品，按1.2.4項下方法制備供試品溶液，按1.2.2項下色譜條件，依次進(jìn)樣測定，記錄樣品色譜圖。

將10批芪斛楂顆粒的HPLC圖譜以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)軟件，采用S1號樣品(批號20190311)的指紋圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度為0.50，中位數(shù)法，經(jīng)多點校正自動匹配后生成芪斛楂顆粒共有模式對照指紋圖譜；確認(rèn)了16個共有峰。10批芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜如圖2所示。

A．10批樣品疊加圖譜； B．共有模式對照圖譜圖2 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜

以共有模式對照指紋圖譜作為參照圖進(jìn)行了相似度計算，10批芪斛楂顆粒樣品與共有模式對照指紋圖譜的相似度在0.985 ～ 0.999，各批樣品的相似度較好。結(jié)果見表1。

表1 10批供試品與對照指紋圖譜的相似度

2.3.2 芪斛楂顆粒復(fù)方與藥材指紋圖譜色譜峰相關(guān)性分析 按1.2.4項下方法制備芪斛楂供試品溶液、藥材對照溶液、芪斛楂顆粒陰性對照溶液，按1.2.2項下色譜條件，記錄色譜圖。利用色譜峰保留時間考察相關(guān)性，對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的16個峰歸屬進(jìn)行分析。

16個共有峰歸屬到各藥材，其中14號峰來源于白術(shù)；2號、6號、14號峰來源于陳皮；4號、5號、7號、15號、16號峰來源于甘草；11號峰來源于黃芪；12號、13號峰來源于流蘇石斛。

2.3.3 采用對照品法對芪斛楂顆粒指紋圖譜各個色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜共有峰和各味藥材色譜峰的歸屬分析，有針對性的配制了甘草苷、橙皮苷對照品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。通過與對照品對比共指認(rèn)了2個色譜峰，確認(rèn)5號峰為甘草苷(如圖3所示)，6號峰為橙皮苷(如圖4所示)。

圖3 芪斛楂顆粒、甘草及甘草苷的圖譜

圖4 芪斛楂顆粒、陳皮及橙皮苷的圖譜

在共有峰中，6號峰是芪斛楂顆粒中的主要活性成分之一，理化性質(zhì)穩(wěn)定，基線分離度好，故選為參照峰。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 本實驗對提取溶劑進(jìn)行篩選，分別用70 %乙醇、95 %乙醇、70 %甲醇、甲醇提取樣品，結(jié)果采用70 %甲醇、甲醇提取所得的色譜峰均較好，為簡便實驗操作及方便溶劑回收利用，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇 本實驗對提取方法進(jìn)行考察，分別采用超聲提取和回流提取樣品，結(jié)果表明，超聲提取和回流提取的結(jié)果無顯著差異，為實驗操作簡便，選擇超聲提取；本實驗對樣品進(jìn)行超聲30 min、超聲60 min提取，結(jié)果表明，使用甲醇超聲30 min和甲醇超聲60 min所得色譜峰一致，為了節(jié)約時間，選擇甲醇超聲30 min作為提取條件。

3.3 流動相的選擇 由于本樣品中成分復(fù)雜，故采用梯度洗脫的方式，先后嘗試甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)，并且嘗試了多種不確定的梯度條件，經(jīng)過對各種色譜圖的比較，最后確定乙腈-水為流動相，采用梯度洗脫，分離度理想，特征峰明顯。

3.4 檢測波長的選擇 取供試品溶液進(jìn)樣，采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較，芪斛楂顆粒大部分成分在230 nm有較大吸收，因此選擇230 nm作為指紋圖譜檢測波長。

3.5 共有峰的歸屬 比較復(fù)方與處方原料藥材的色譜圖發(fā)現(xiàn)，處方藥材對共有峰的貢獻(xiàn)為白術(shù)(14號峰)、陳皮(2號、6號、14號峰)、甘草(4號、5號、7號、15號、16號峰)、黃芪(11號峰)、流蘇石斛(12號、13號峰)。所歸屬的色譜峰都能與藥材和復(fù)方對應(yīng)，有良好的相關(guān)性。14號峰的貢獻(xiàn)來源于白術(shù)和陳皮。雖然有與茯苓對照藥材相對應(yīng)的色譜峰(16號峰)，但在茯苓陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明16號峰不是茯苓專屬，僅與茯苓有關(guān)；雖然有與山楂對照藥材相對應(yīng)的色譜峰(1號、2號峰)，但在山楂陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明這兩個色譜峰不是山楂專屬，僅與山楂有關(guān)；未見與黨參、麥芽、木瓜、山藥有關(guān)的色譜峰，可能由于復(fù)方在煎煮過程中，成分之間相互發(fā)生作用導(dǎo)致成分轉(zhuǎn)化或損失；其中3號、8號、9號、10號峰不能得到歸屬，可能是在制劑制備過程中11味藥材共煎而產(chǎn)生的。綜上所述，復(fù)方與處方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡單的加和關(guān)系。本實驗對復(fù)方成分的來源歸屬作了初步研究，為闡明芪斛楂顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

本研究通過精密度試驗、穩(wěn)定性試驗和重復(fù)性試驗對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，建立了芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定16個共有峰，指認(rèn)了其中2個色譜峰。采用所建立的方法對10批芪斛楂顆粒樣品進(jìn)行了指紋圖譜測定，采用相似度分析方法對樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，本研究建立的芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為葵花藥業(yè)芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。