倒心盾翅藤總皂苷提取工藝優(yōu)化

王婉麗 樊 馨 陳雄敏 李婷婷 楊亞彬 李宜航 李 光*

1．西雙版納傣族自治州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 景洪 666100；2．滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)傣醫(yī)藥學(xué)院，云南 景洪 666100；3.西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院，云南 景洪 666100；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100

傣藥倒心盾翅藤為AspidopterysobcordataHemsL.金虎尾科植物倒心盾翅藤的木質(zhì)藤莖，傣藥名嘿蓋貫，主要分布于越南、緬甸北部、泰國以及我國的海南、云南等地，生長在山地雨林、溝谷雨林及季雨林的林緣、疏林及灌木叢中[1-2]。該藥性澀、涼，有消炎利尿、清熱排石之功效，傣族民間常用于泌尿系炎癥、感染及結(jié)石的治療，也用于產(chǎn)后消瘦，惡露不盡等癥，是傣醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)方“五淋化石膠囊”的主要組方藥材，同時也是目前傣醫(yī)臨床用量最大的一味藥材[1, 3]。倒心盾翅藤中含有多種類型的化學(xué)成分，包括鞣質(zhì)、甾體、酚酸、蒽醌、三萜以及黃酮類化合物，經(jīng)實驗證實具有抗炎、抗腫瘤、抗結(jié)石等多種藥理活性[4-5]。在抗結(jié)石活性的研究中，倒心盾翅藤中甾體總皂苷被逐步證實是其抗結(jié)石的主要活性成分之一[6-7]。為了更好的滿足防治腎結(jié)石的需求，也是為了充分開發(fā)利用倒心盾翅藤植物資源，本研究對倒心盾翅藤甾體總皂苷的提取方法進行了優(yōu)化，并對提取物活性進行了驗證。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 分析天平(美國奧豪斯，DV215CD)；小型臺式組織脫水機(賽默飛世爾科技，STP 120)；組織包埋機(賽默飛世爾科技，HISTOSTAR)；全自動切片機(賽默飛世爾科技，HM355S)；染色機(賽默飛世爾科技，GEMINI AS)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(中興，101型)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,BX53)；離心機(SIGMA，3K15)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療器械有限公司，DZKW-S-6)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI Labortechnik AG，R-210)；超聲清洗機(寧波科技園區(qū)新江南儀器有限公司，JN-500DT)；真空泵(萊伯泰科，VP50)。

1.2 實驗藥材與試劑 倒心盾翅藤藥材飲片購于西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，保存于樣品室，提取前粉碎過篩。菝葜皂苷元(中國科學(xué)院成都生物研究所，批號：MUST-18081402，純度：99.57%)；茴香醛(阿達瑪斯，批號：P1438355，質(zhì)量分數(shù)：99%以上)；無水乙醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；甲醇(分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；硫酸(分析純，重慶川東化工有限公司)；水為自制純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甾體總皂苷的測定方法

2.1.1 工作溶液的配制 樣品溶液：倒心盾翅藤粉末加乙醇回流提取，濃縮、干燥，即得樣品。精密稱取樣品適量，加甲醇，配制成1 mg·mL-1的供試品溶液。對照品溶液：精密稱取菝葜皂苷元對照品加甲醇溶解定容，配制成0.2 mg·mL-1的對照品溶液。顯色劑：取8 mL甲醇至10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL濃硫酸，冷卻至室溫, 加100 μL茴香醛, 搖勻，即得1%茴香醛-硫酸顯色劑[8-9]。

2.1.2 線性關(guān)系考察 取1 mL對照品溶液揮干，加入4 mL顯色劑，置100 ℃水浴中保溫20 min，冰水浴10 min，補加顯色劑至10 mL，以甲醇做空白對照于380～800 nm波長進行掃描[8-10]。菝葜皂苷元在428.5 nm處有最大吸收峰，選擇 428.5 nm作為測定波長。

分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL揮干，顯色后于428.5 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，甾體總皂苷濃度為縱坐標(biāo)，計算得到回歸方程為：y=0.3686x- 0.012，R2=0.9966，線性范圍0.04088～0.4088。

2.2 單因素試驗考察及結(jié)果

2.2.1 考察乙醇體積分數(shù)對總皂苷得率的影響 選擇液料比為11.5、提取溫度為75 ℃、提取時間為1.5 h，乙醇體積分數(shù)分別為35%、50%、65%、80%、95%、100%，加熱提取后濃縮回收乙醇，測定皂苷含量，計算得率。乙醇體積分數(shù)為50%時，總皂苷得率最高，為2.15%。當(dāng)乙醇體積分數(shù)超過50%以后，總皂苷得率開始下降，故選擇乙醇體積分數(shù)為50%最佳，見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總皂苷得率的影響

2.2.2 考察液料比對總皂苷得率的影響 在乙醇體積分數(shù)為65%、75 ℃、提取1.5 h條件下，液料比分別為4.5、8、11.5、15、18.5、22進行提取，比較總皂苷得率。隨著液料比增大，總皂苷得率總體呈上升趨勢，液料比達到22時，總皂苷得率2.44%。考慮到實際生產(chǎn)中成本的投入與產(chǎn)率，故選擇液料選擇15最佳，見圖2。

圖2 液料比對總皂苷得率的影響

2.2.3 考察提取溫度對總皂苷得率的影響 使用65%乙醇、液料比為11.5，分別在75 ℃、85 ℃、95 ℃、100 ℃下回流提取1.5 h，比較總皂苷得率。隨著提取溫度的升高，總皂苷得率呈上升趨勢。100 ℃時，總皂苷得率達到最高，為2.21%，見圖3。

圖3 提取溫度對總皂苷得率的影響

2.2.4 考察提取時間對總皂苷得率的影響 選擇65%乙醇、液料比為11.5、75 ℃分別提取1、2、3 h，計算總皂苷得率如圖4所示。隨著提取時間增加，總皂苷得率不斷增加，達到3 h時總皂苷得率為1.77%。在實際生產(chǎn)中考慮到成本的生產(chǎn)效率，故提取時間選擇3 h。如圖4所示。

圖4 提取時間對總皂苷得率的影響

2.3 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝及結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行4因素3水平設(shè)計，采用Design Expert 10軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗。選取甾體總皂苷得率作為響應(yīng)值，乙醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)自變量進行實驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

對表1和表2中的試驗結(jié)果進行擬合分析，得到倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取工藝參數(shù)回歸方程為：Y=1.43-0.50A+0.079B+0.21C+0.034D+0.37AB-0.21AC+0.018AD+0.37BC+0.095BD+0.084CD。回歸模型的P值=0.0008(P<0.01)，差異顯著，且失擬項P值=0.7412(P>0.05)，差異不顯著，決定系數(shù)R2=0.7575，表明無失擬因素存在，方程與試驗擬合度較好，可用于倒心盾翅藤中總甾體總皂苷提取。見表2。

表2 響應(yīng)面ANOVA結(jié)果分析

回歸方程各項方差分析表明4個影響因素對倒心盾翅藤中甾體總皂苷含量影響的大小順序依次為：乙醇體積分數(shù)>提取溫度>液料比>提取時間，方程一次項(A、C)和交互項(AB、BC)影響都是顯著的(P<0.05)，方程一次項(B、D)和交互項(AC、AD、BD、CD)影響不顯著(P>0.05)。

各因素兩兩交互作用對總皂苷含量的影響的3D響應(yīng)曲面圖如圖5所示，乙醇體積分數(shù)和液料比、乙醇體積分數(shù)和提取溫度、液料比和提取溫度響應(yīng)曲面圖等高線呈橢圓形，表明兩因素之間交互作用顯著；而提取溫度和提取時間、液料比和提取時間、乙醇體積分數(shù)和提取時間兩因素之間的交互作用不顯著。該結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對總皂苷提取率的影響

根據(jù)回歸模型最優(yōu)組合分析，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為: 乙醇體積分數(shù)50.28%、液料比15、提取溫度99.99℃、提取時間3h，其倒心盾翅藤中甾體總皂苷得率預(yù)測值為2.43%。根據(jù)實際情況調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時間3 h進行倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取驗證試驗，3次平行試驗實際測得的甾體總皂苷平均得率為2.37%±0.19%，與模型理論預(yù)測值之間的相對誤差為1.65%，表明所得結(jié)果準確可靠。

2.4 倒心盾翅藤總皂苷生物活性驗 人腎小管上皮細胞HK-2復(fù)蘇后，完全MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每3天換液一次。細胞生長至85%以上密度時胰酶消化傳代，接種到96孔板中，每孔4000個細胞，培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基，加入含有一水草酸鈣結(jié)晶和倒心盾翅藤總皂苷的無血清MEM培養(yǎng)基100 μL，每孔一水草酸鈣含量為28 μg·cm-2，給藥組倒心盾翅藤總皂苷含量分別為1.56，3.12，6.25，12.5，25.0 μg·mL-1，每個劑量設(shè)置3個復(fù)孔。空白對照孔加入等體積無血清MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，小心移除培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑 10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，酶標(biāo)儀中450 nm處測定OD值。計算細胞相對存活率：各組OD值/空白組OD值×100%。結(jié)果采用均數(shù)加減標(biāo)準差的方式表示，各組間的比較采用單因素方差分析法，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果證明，倒心盾翅藤總皂苷在1.56～25.0μg·mL-1范圍內(nèi)可以明顯減輕由草酸鈣結(jié)晶引起的HK-2細胞的損傷，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。這表明，上述工藝獲得的總皂苷可通過減少腎小管上皮細胞損傷抑制結(jié)石成分的黏附，具有防治腎結(jié)石的生物活性。

表3 倒心盾翅藤總皂苷對HK-2細胞草酸鈣損傷模型的影響

3 討論

皂苷是糖的衍生物，非糖的部分稱為苷元。甾體皂苷的苷元部分是螺甾烷的衍生物，主要分布薯蕷科、百合科等植物中，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、增強免疫、抗菌等多種功效[11]。倒心盾翅藤中的甾體皂苷成分也是其治療腎結(jié)石有效成分之一。甾體皂苷的檢測方法通常有分光光度法和高效液相法。為了優(yōu)化提取工藝，本研究首先建立了倒心盾翅藤甾體皂苷成分的檢測方法。因倒心盾翅藤甾體皂苷成分在液相色譜儀的紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器中均無吸收峰，因此采用了分光光度法。分別測試了濃硫酸-甲醇、茴香醛-硫酸、香草醛冰乙酸三種顯色試劑，確定經(jīng)過1%茴香醛-硫酸顯色結(jié)果較好[9, 12-13]。顯色后，菝葜皂苷元和受試樣品在428.5 nm處有吸收，據(jù)此建立了較為可靠的倒心盾翅藤甾體皂苷比色定量方法。

甾體皂苷提取工藝包括冷浸提取、加熱提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、酶法輔助提取等多種形式。本研究中應(yīng)用的是加熱提取法，符合工廠生產(chǎn)的常規(guī)工藝，并優(yōu)選了乙醇和水作為提取溶劑，避免了有機試劑的殘留。根據(jù)單因素實驗優(yōu)選倒心盾翅藤甾體皂苷的提取方法，作為響應(yīng)曲面試驗的因素水平，通過 Box- Behnken 響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間對皂苷得率的影響，確定了最佳的提取工藝為乙醇體積分數(shù)50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時間3 h，該條件下甾體總皂苷得率為2.37%±0.19%，與模型預(yù)測值相符。所獲得的皂苷經(jīng)過體外細胞實驗驗證，具有抗腎結(jié)石的生物活性。本研究提出的倒心盾翅藤甾體皂苷提取工藝穩(wěn)定可行，所獲得產(chǎn)物藥理活性較為明確，為倒心盾翅藤的開發(fā)應(yīng)用提供了參考。