非小細(xì)胞肺癌患者調(diào)強(qiáng)放療后Treg/Th17平衡改變與放療效果、預(yù)后的關(guān)系

孟憲宇 張 萍 侯永杰

肺癌早期常無明顯癥狀，多數(shù)患者診斷即為晚期，因此患者病死率高，預(yù)后較差，且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%以上，是最常見的肺癌組織學(xué)類型[2]。調(diào)強(qiáng)放療(intensity modulated radiotherapy，IMRT)為三維適應(yīng)性放療的一種，在增加靶區(qū)照射劑量的同時減少對正常組織的放療劑量，能夠有效提升腫瘤控制率，減輕正常組織的損傷[3]，但放療效果及預(yù)后受多種因素影響，難以評估。近年來Treg/Th17比例失衡在多種疾病中作為預(yù)后指標(biāo)而被報道[4]。研究表明CD4+淋巴細(xì)胞亞群在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[5]，其分化形成的輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在機(jī)體免疫過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6]。Th17細(xì)胞能夠特異性分泌白介素17(IL-17)和白介素23(IL-23)，在腫瘤中發(fā)揮促血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的作用[7]。Treg細(xì)胞分泌的TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[8]，且Treg/Th17平衡常發(fā)生改變。有研究表明腫瘤患者Treg/Th17平衡改變與治療效果及預(yù)后密切相關(guān)[9]，但該研究針對NSCLC的報道較少。本研究探討NSCLC患者接受IMRT治療后Treg/Th17及細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-23水平與放療效果及預(yù)后的關(guān)系，旨在為NSCLC放療效果及預(yù)后評估提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選擇本院胸外科2014年5月至2017年5月收治的80例晚期非小細(xì)胞肺癌患者作為研究組，其中男性48例，女性32例，年齡40～76(56.48±8.67)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者通過組織學(xué)檢查確診為NSCLC[10]。②患者在確診前未進(jìn)行化療、放療、靶向治療和生物免疫治療。③患者各臟器功能良好，無放療禁忌證。④患者臨床資料完整，包括年齡、性別、病理分級、腫瘤直徑等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)診斷為CPOD、慢性肺部疾病、自身免疫病等非NSCLC患者。②出現(xiàn)臟器功能異常無法耐受放療的患者和出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥的患者。③診斷后未在我院接受治療的患者。另選取同期在我院體檢健康人80例作為對照組。對照組中男性44例，女性36例，年齡43～72(55.37±7.49)歲。該研究納入對象均簽署對研究的知情同意書并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測患者Th17、Treg細(xì)胞水平

無菌抽取對照組和放療前后NSCLC患者靜脈血5 ml于肝素抗凝管中，分離外周血中單個核細(xì)胞與12孔板中培養(yǎng)。加入佛波酯和離子霉素繼續(xù)培養(yǎng)1 h后加入高爾基體抑制劑，培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞。用PE標(biāo)記的CD8單抗和FITC標(biāo)記的CD3單抗對Th17細(xì)胞進(jìn)行染色，之后進(jìn)行固定和破膜，再用APC標(biāo)記的IL-17A進(jìn)行標(biāo)記；用FITC標(biāo)記的CD4單抗和PE標(biāo)記的CD25單抗對Treg細(xì)胞進(jìn)行染色，固定破膜后使用APC標(biāo)記的Foxp3單抗進(jìn)行標(biāo)記，所有抗體均購買自美國BD公司。用Beckman公司流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CD3+、CD8-、IL-17A+者為Th17細(xì)胞，而CD4+、CD25+、Foxp3+者為Treg細(xì)胞。

1.3 ELISA法檢測患者相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測對照組和放療前后NSCLC患者血清中白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transformipg growth factor-β，TGF-β)、白介素-17(Interleukin-17，IL-17)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)的水平。抽取患者靜脈血制備血清，使用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)檢測患者血清細(xì)胞因子表達(dá)水平。使用酶標(biāo)儀檢測濃度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出結(jié)果。

1.4 患者放療方法及效果隨訪

所有患者均采用調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)，患者取仰臥位，常規(guī)分割照射劑量每次2 Gy，總劑量50～60 Gy，心臟限制劑量V30≤40%。患者均在腫瘤出現(xiàn)進(jìn)一步發(fā)展時停止治療，對患者瘤體大小進(jìn)行測量并根據(jù)WHO實體瘤客觀療效評定標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評價，療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。隨訪采用門診、電話等方式，隨訪間隔3個月，末次隨訪時間為2019年5月。患者隨訪期間無疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡者定義為預(yù)后良好，未及以上標(biāo)準(zhǔn)者定義為預(yù)后不良。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 2組Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

研究組外周血中Th17、Treg細(xì)胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 2組Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

2.2 NSCLC患者放療前后Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

放療后NSCLC患者外周血Th17、Treg細(xì)胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值顯著低于放療前，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2 NSCLC患者放療前后Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

2.3 放療后不同效果組患者Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

80例NSCLC患者放療后獲得CR 12例、PR 23例、SD 27例、PD 18例。CR組、PR組、SD組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值顯著低于PD組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 放療后不同效果組Treg/Th17及細(xì)胞因子水平比較

2.4 Treg/Th17及細(xì)胞因子水平與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪結(jié)束時失訪3例，預(yù)后較好患者47例，預(yù)后不良患者30例。預(yù)后較好患者外周血Th17、Treg細(xì)胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值顯著低于預(yù)后不良患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 Treg/Th17及細(xì)胞因子水平與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

肺癌是最常見惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年上升，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者5年生存率低，嚴(yán)重威脅人類健康[11]。目前對于NSCLC的治療主要以化療為主，但放療在NSCLC的治療中也十分重要。調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)是通過調(diào)節(jié)射線強(qiáng)度對腫瘤進(jìn)行精準(zhǔn)放療的方法，可根據(jù)腫瘤大小和放射劑量進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高腫瘤照射劑量的同時減少對周圍組織的損傷，是目前臨床常用的放療方式[12]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫密切相關(guān)，體內(nèi)一些免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化能對腫瘤治療效果和預(yù)后進(jìn)行反饋[13]。CD4+T淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，研究表明其可在特定條件下分化成為輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[14]。Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群，主要通過分泌特異性細(xì)胞因子IL-17發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，Th17在機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，但也和許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。有研究表明IL-17能夠通過促進(jìn)腫瘤微血管生成，增加腫瘤內(nèi)微血管的數(shù)量和密度，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[16]，在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Th17及其效應(yīng)分子IL-17的高表達(dá)[17]。Treg是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其主要效應(yīng)分子為TGF-β和IL-10。IL-10是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，由淋巴細(xì)胞釋放參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。研究表明IL-10能夠發(fā)揮免疫抑制作用，其表達(dá)水平升高常與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[18]。而TGF-β具有抑制抗腫瘤免疫、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[19]。Treg還通過抑制多種效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和活化維持免疫穩(wěn)態(tài)[20]。在許多腫瘤患者體內(nèi)Treg水平升高，抑制T細(xì)胞的作用，在誘導(dǎo)腫瘤免疫耐受的過程中發(fā)揮重要作用[21]。學(xué)者Yang等[22]發(fā)現(xiàn)Treg/Th17平衡在維持免疫穩(wěn)態(tài)過程中十分重要。Treg/Th17平衡改變與多種疾病相關(guān)，平衡傾向Treg時有利于多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，這種改變在胃癌及宮頸癌患者體內(nèi)均被發(fā)現(xiàn)[23]，但與NSCLC相關(guān)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平，Treg、Th17細(xì)胞水平和Treg/Th17均高于正常人，提示NSCLC的發(fā)病與Treg/Th17平衡傾向Treg有關(guān)。IMRT治療后NSCLC患者上述指標(biāo)較化療前均下降，說明IMRT治療能夠改善NSCLC患者Treg/Th17平衡傾向Treg。接受IMRT治療的患者CR組、PR組、SD組與PD組相比上述指標(biāo)均明顯下降，提示改善Treg/Th17平衡改變與患者放療效果相關(guān)。預(yù)后較好的患者上述指標(biāo)顯著低于預(yù)后不良患者，提示改善Treg/Th17平衡改變與患者預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，NSCLC患者Treg/Th17平衡改變與患者化療效果和預(yù)后相關(guān)，改善NSCLC患者Treg/Th17平衡改變可以提升放療效果，改善患者預(yù)后。Th17/Treg平衡一定程度上參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，但在NSCLC中發(fā)揮的具體作用仍需進(jìn)一步探究。