TM4SF1水平與胃癌病理特征的相關性

李昌安 汪明強 馬志勇 李雪平

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常見的惡性胃腸道癌，也是全球第二大癌癥相關死亡原因，盡管治療手段不斷改進，但是GC的預后仍然很差[1-2]。跨膜4超家族成員1(Transmembrane-4-L-six-family-1，TM4SF1)，也稱為腫瘤相關抗原L6，是一種22 kda的四跨膜結構域蛋白[3]。TM4SF1在各種人類上皮惡性腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌)的質膜和細胞內小泡中異常表達，在正常血管內皮細胞中則高表達[4]。免疫熒光顯微鏡也顯示TM4SF1沉積在細胞質中，并初步存在于培養的內皮細胞和腫瘤細胞的細胞核中。TM4SF1已被證明與腫瘤細胞的生長、運動、侵襲和轉移有關。然而，TM4SF1在包括人類胃癌在內的癌癥中的確切作用仍不清楚。因此本文選取68例胃癌患者的臨床資料進行回顧性分析，探討TM4SF1水平與胃癌病理特征的相關性，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年5月至2020年4月共收治的68例胃癌患者作為研究對象。納入標準：經胃鏡檢查及組織病理學確診為胃癌；接受紫杉醇、氟尿嘧啶等常規化療藥物治療；身體狀況及血液檢查均能耐受化療；研究經醫院倫理委員會批準，患者簽字同意。排除標準：胃癌遠端轉移且不能進行根治性手術；合并其他嚴重惡性腫瘤；合并心、肝、腎等器官疾??；合并感染性或代謝性疾??；有慢性營養不良史。68例患者中男性39例，女性29例；年齡為42～68歲，平均年齡(54.32±8.92)歲；病程3個月～1年，平均(0.64±0.34)年。

1.2 方法

所有患者均采用胃癌根治術切除病灶組織并作為研究樣本，去除結締組織及壞死組織；并于病灶四周5 cm以外取胃黏膜組織作為癌旁組織樣本。TM4SF1染色的免疫組化及定量分析：石蠟包埋切片(4 μm厚)去石蠟切片，再水化，在10 mmol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)中加熱10 min，以回收抗原。內源性過氧化物酶用3%H2O2猝滅。在4 °C下與一級抗體(抗TM4SF1，1∶200，Abcam)孵育后，用辣根過氧化物酶標記的聚合物與二級抗體(Max Vision)于室溫下共同孵育15 min后，在二氨基聯苯胺中顯影并用蘇木精輕微復染。陰性對照組除不加原發性抗體外，其余程序均相同。免疫組化結果由兩名對臨床資料不了解的病理學家獨立評估。在×200的條件下，對每個截面進行了5個隨機視野檢查。腫瘤組織中TM4SF1的表達程度采用分級系統：0分為陰性染色；1分為淺黃色染色；2分為淺棕色染色；3分為深褐色染色。得分0定義為TM4SF1陰性，分數1～3為TM4SF1陽性。

免疫分析法：將均質化的根治性手術前胃癌組織和根治性手術后胃黏膜組織織標本置于RIPA裂解緩沖液中進行裂解。在4 ℃下將裂解物(13 800 g)離心30 min。上清液用于Western blotting分析。用十二烷基硫酸鈉(SDS)負載緩沖液變性，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，用兔抗TM4SF1單克隆抗體(1∶1000稀釋度，Abcam)或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2000稀釋度，Sigma-Aldrich)在4 ℃下孵育過夜。在用Tris-緩沖鹽水和吐溫-20(TBST)洗滌3次，每次10 min后，在室溫下用辣根周氧化酶(HRP)結合的小鼠抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)探測1 h。用TBST洗滌后，使用化學發光光電表面辣根過氧化物酶試劑盒進行顯色并觀察，具體顯色過程根據試劑盒制造商的相關說明。采用Quantity One軟件(Bio-Rad，Hercules，CA)用密度計測量譜帶強度。TM4SF1蛋白水平標準化為GAPDH。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織TM4SF1表達水平對比

免疫組化分析顯示，在GC組織中TM4SF1的陽性表達率為(16.6±3.9)%，顯著低于癌旁組織的陽性表達率(57.4±11.0)%，差異有統計學意義(t=8.563，P<0.001)。

2.2 TM4SF1表達與胃癌患者臨床病理特征的相關性

TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入深度對比無明顯差異(P>0.05)，TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤TNM分期情況對比差異顯著(P<0.05)，如表1所示。

表1 TM4SF1表達與胃癌患者的臨床病理特征的相關性

2.3 TM4SF1水平與胃癌病理特征相關性分析

Spearman相關分析結果顯示：TM4SF1水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入程度無明顯相關性(P>0.05)，TM4SF1水平與胃癌患者的淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤TNM分期呈負相關(P<0.05)，如表2所示。

表2 TM4SF1水平與胃癌病理特征相關性分析

3 討論

跨膜4超家族成員1(TM4SF1)在多種上皮來源的腫瘤中出現異常表達，如胰腺癌、肝癌、結直腸癌等。TM4SF1參與調控腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移等過程，有望成為腫瘤早期診斷、病情預測及預后的指標，因其在惡性腫瘤細胞中選擇性表達，也可成為腫瘤靶向治療的靶點。相關研究顯示[5]，USP10、S100A12、p53和Ki67是癌癥侵襲和轉移的腫瘤分子標志物。還有研究顯示[6]，S100A12的表達與侵襲深度有關，并被評估為GC整體生存率差的獨立危險因素，p53和Ki67是癌癥進展的既定標志物。在目前的研究中[7]，我們發現TM4SF1的表達與胃癌中USP10、S100A12、p53或Ki67的表達沒有相關性，這表明TM4SF1在胃癌侵襲轉移中起著不同于USP10、S100A12、p53或Ki67的作用。TM4SF1在胃癌侵襲轉移中的確切作用值得進一步研究。

相關研究顯示[8]，TM4SF1低表達與胃癌的發生發展有關。還有研究顯示[9]，胃癌與肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌等不同，胃癌患者的TM4SF1 mRNA和蛋白水平比較低，與本研究相符；TM4SF1在GC組織中呈陰性表達，在相鄰非癌組織中呈陽性表達。在我們的患者隊列中，免疫組化分析顯示，在GC組織中TM4SF1的表達率，顯著低于非癌性胃黏膜組織表達率(P<0.05)。相關研究表明[10]，TM4SF1在多種類型的上皮來源惡性腫瘤與供應腫瘤血管內皮呈現低表達狀態。還有研究表明[11]，TM4SF1的過表達會促進乳腺癌細胞中MAD-MB-231轉移，并且抑制其凋亡情況。Tu，S等研究發現[12]，TM4SF1在侵襲性膀胱癌組織之中表達高于癌旁組織。本研究發現TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入深度對比無明顯差異(P>0.05)，TM4SF1陰性患者與TM4SF1陽性患者的淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤TNM分期情況對比差異顯著(P<0.05)，由此證明，TM4SF1的丟失對胃癌細胞的侵襲和遷移有促進作用。然而，其他研究表明[13]，TM4SF1的高表達與MIBC(肌肉浸潤性膀胱癌)患者的T分期、TNM分期、淋巴結轉移狀況有關。TM4SF1在腫瘤進展和侵襲中的作用似乎也是組織特異性的。Spearman相關分析結果顯示：TM4SF1水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小和侵入程度無明顯相關性(P>0.05)，TM4SF1水平與胃癌患者的淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤TNM分期呈負相關(P<0.05)，由此證明，TM4SF1可能參與了胃癌的發生發展過程，可以作為胃癌患者治療和預后情況判斷的重要指標。

綜上所述，胃癌組織中TM4SF1蛋白水平低于癌旁組織，是GC的抑癌劑，也是胃癌患者的一種新的預測標志物，但其確切作用機制仍有待進一步研究。