TRAF6、Nectin-4在食管癌組織中的表達水平及臨床意義

賈艷紅 劉智慧 魏新朋

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，全世界每年近一半的新發病例與死亡病例發生在我國[1]。食管癌起病較為隱匿，且早期診斷率低，導致患者就診時常為晚期[2]，患者常因吞咽困難導致營養不良或腫瘤進展伴發血栓形成導致預后不良的發生[3]。化療是針對晚期食管癌的有效方法[4]，但缺少化療效果的評價指標，尋故找與食管癌預后及化療效果的相關指標具有重要的臨床意義。研究發現腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)在多種惡性腫瘤中呈高表達，調控腫瘤細胞增殖轉移等生命活動[5]，其高表達常預示患者預后不良的發生[6]。而連接蛋白4(Nectin-4)屬于免疫球蛋白黏附分子家族中的一員[7]，在腫瘤細胞侵襲過程中發揮重要作用。TRAF6、Nectin-4促進腫瘤的發生發展，但在食管癌中的作用尚不明確。本研究采用免疫組織化學法及RT-PCR檢測技術檢測TRAF6、Nectin-4在食管癌組織中的表達水平，旨在為食管癌的化療效果及預后評估提供相關依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年6月至2017年6月本院腫瘤科收治的91例食管癌患者，食管癌診斷、分型依據食管癌診療規范(2018版)[8]，患者均經胃鏡及影像學檢查確診為食管癌，并依據國際抗癌聯合會(UICC)第八版肺癌TNM分期標準[9]將腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ期。所有入組患者均為初診，就診前未經放、化療，靶向治療及生物免疫治療；患者身體狀況良好，無化療禁忌癥，未合并重要臟器功能損傷；患者臨床資料完整。91例患者中男性67例、女性24例，年齡48～78(65±8.24)歲。患者組織標本為食管癌根治術中剪取腫瘤中部組織和癌旁正常組織，標本均保存于-80 ℃中。所有研究對象及家屬均簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2 化療方案與療效評估

食管癌患者均采用一線化療方案紫杉醇聯合鉑類進行化療，注射用紫杉醇(國藥準字H20183044，石藥集團歐意藥業有限公司)用量為：50 mg/m2，于化療周期第一天靜脈滴注；卡鉑注射液(波貝，國藥準字H20020180，齊魯制藥有限公司)用量為：AUC=2，于化療周期第一天靜脈滴注。7 d為一個治療周期，共化療5～6個周期。化療結束后依據《實體腫瘤治療反應評價指南》[10]評估化療效果，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。采用門診、電話、微信等方式對患者進行隨訪，隨訪間隔3個月，患者出現死亡或截止2020年6月終止隨訪。

1.3 免疫組織化學法檢測TRAF6、Nectin-4的表達

標本采用SP免疫組織化學法試劑盒檢測TRAF6、Nectin-4的表達情況。DBA顯色后加入蘇木精復染，梯度酒精脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。按染色強度記分：無染色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、深棕色3分。再按陽性細胞密度打分：高表達細胞<25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。參照文獻[11-12]以兩項評分相乘獲得結果，結果≤6分為低表達，>6分為高表達。TRAF6、Nectin-4一抗均購自美國Abcam公司，HRP標記山羊抗兔二抗、免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.4 RT-PCR技術檢測TRAF6、Nectin-4 mRNA水平

采用Trizol法提取腫瘤組織及癌旁組織中總RNA，NanoDrop 2000檢測樣品合格。采用逆轉錄PCR一步法試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，嚴格按照說明書所述進行操作。以GAPDH為內參，檢測TRAF6、Nectin-4 mRNA的相對表達量。引物均委托上海生工生物公司設計合成，序列為TRAF6 mRNA：F：5’-TCCACACAATGCAAGGAGAA-3’，R：5’-GGGCTTCCAGATGCATAAAA-3’；Nectin-4 mRNA：F：5’-CAAAATCTGTGGCACATT-GG-3’，R：5’-GCTGACATGGCAGACGTAGA-3’。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4表達情況

免疫組化結果顯示：TRAF6、Nectin-4在腫瘤組織中的表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.001)，RT-PCR結果顯示：腫瘤組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA相對表達量明顯高于癌旁組織(P<0.001)，見表1～2。

表1 腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4表達情況/例

表2 檢測腫瘤及癌旁組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA相對表達量

2.2 TRAF6、Nectin-4水平與食管癌臨床病理特征的關系

結果表明：腫瘤組織中TRAF6、Nectin-4高表達與患者年齡、性別、腫瘤類型及發生部位無關(P>0.05)，但與有無淋巴結轉移及腫瘤分期相關(P<0.05)，見表3。

表3 TRAF6、Nectin-4水平與食管癌臨床病理特征的關系/例

2.3 TRAF6、Nectin-4水平與化療效果的關系

患者經化療后分為CR組14例、PR組31例、SD組27例、PD組19例。各效果組組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平具有統計學差異(P<0.001)，CR組、PR組患者組織中TRAF6、Nectin-4 mRNA水平明顯低于PD組患者(P<0.05)，見表4。

表4 TRAF6、Nectin-4表達水平與化療效果的關系

2.4 TRAF6、Nectin-4水平與患者預后的關系

截止到2020年6月，91患者中存活47例，死亡41例，失訪3例，存活率為51.65%。所有死亡患者均死于腫瘤進展、復發及相關并發癥。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示：組織中TRAF6、Nectin-4高表達患者36個月生存率明顯低于低表達患者，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 組織中TRAF6、Nectin-4水平與患者生存率的關系

3 討論

本研究通過免疫組化及RT-PCR技術檢測TRAF6、Nectin-4在食管癌患者組織中的表達情況，發現食管癌組織中TRAF6、Nectin-4蛋白及mRNA表達水平明顯高于癌旁組織。研究表明TRAF6蛋白是腫瘤壞死因子超家族和Toll樣受體超家族的重要銜接分子[13]，其活化后可同時激活NF-kB和MAPK通路，促進腫瘤細胞增殖、侵襲，并抑制腫瘤細胞凋亡[14]。

TRAF6還可通過Beclin-1及p62基因參與對腫瘤細胞自噬的調控，在腫瘤耐藥中發揮關鍵作用[15]。另一方面TRAF6蛋白還可作為1種E3泛素連接酶催化形成賴氨酸-63-多聚泛素鏈，活化UPP途徑介導肌蛋白分解引起肌肉萎縮，增加蛋白質的消耗，常導致患者惡病質的發生[16]。研究發現胃癌患者組織中TRAF6高表達與患者腫瘤分期、浸潤深度相關，常預示患者預后不良的發生[17]；miR-146a-5p可通過靶向調控TRAF6抑制非小細胞肺癌化療耐藥的發生[18]；而下調卵巢癌細胞中TRAF6的表達能夠延緩腫瘤生長速度、促進腫瘤細胞凋亡，并有效提高對化療藥物的敏感性[19]。本研究還結果顯示TRAF6在Ⅲ、Ⅳ期食管癌及伴隨淋巴結轉移的患者組織中呈高表達，提示TRAF6促進腫瘤細胞的發增殖轉移，且其高表達與患者化療效果不佳相關，提示TRAF6參與介導腫瘤耐藥的發生，該結果與之前的研究具有一致性，但機制尚不完全明確。

Nectin-4是細胞間粘附系統的重要組成成員，通過形成同順勢二聚體以非Ca2+依賴的形式與E-鈣黏素共同維持細胞間粘附的動態平衡[20]。細胞間粘附喪失是腫瘤開始侵襲轉移的關鍵一步，Nectin-4通過活化Rac和Cdc42引起細胞骨架肌動蛋白改變，形成板狀偽足和絲狀偽足，啟動腫瘤細胞浸潤和轉移[21]。研究表明Nectin-4與乳腺癌轉移密切相關，浸潤性乳腺癌和腫瘤轉移患者組織中Nectin-4呈高表達[22]，在卵巢癌及肺癌組織中也檢測出Nectin-4的高表達；國內學者陳君等[23]的研究發現姜黃素能夠通過下調Nectin-4的表達抑制了肺癌細胞侵襲和轉移的能力。本研究發現Nectin-4在食管癌組織中高表達與腫瘤分期及轉移相關，且其高表達患者死亡率較高，提示Nectin-4促進腫瘤細胞侵襲和轉移，與先前的研究結果一致。綜上所述TRAF6、Nectin-4在食管癌組織中呈高表達，且與患者腫瘤分期及有無淋巴結轉移相關，而TRAF6、Nectin-4高表達患者化療效果通常較差，且死亡率也高于低表達患者。

組織中TRAF6、Nectin-4水平可能作為食管癌患者化療效果及預后的預測指標發揮臨床作用，針對其相關研究將為食管癌的診斷及治療提供依據，但TRAF6、Nectin-4是否為食管癌轉移的必要因素及其促進食管癌發生發展的機制仍需進一步探索。