復肝春3號方對肝硬化腹水大鼠血管活性物質、水通道蛋白的影響*

管佳暢 張志威 毛宇湘△

1.河北醫科大學第四醫院中醫科 (河北 石家莊， 050011) 2.河北省中醫院脾胃病二科

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復作用于肝臟導致，是一種慢性、進行性、彌漫性的肝病終末階段。肝硬化早期表現隱匿，不易察覺，晚期以肝功能減退和門脈高壓為主要臨床表現，常出現多種并發癥，如腹水、消化道出血、肝性腦病等。腹水是肝硬化失代償期最突出的臨床表現，大約75%以上失代償期患者會出現腹水[1]。腹水的形成不但影響患者生活質量，而且增加了自發性腹膜炎、上消化道出血、腎功能衰竭或肝性腦病等風險，提示預后不良。因此對肝硬化腹水形成機制的研究一直是臨床研究的熱點、難點。目前對于肝硬化腹水主張綜合治療，而中醫藥作為綜合療法中的重要組成部分，因其整體觀念強，能夠調理機體的內環境，提高機體免疫功能，緩解臨床癥狀體征，改善生活質量，防治并發癥，且無創傷、毒副作用小，價格便宜等，越來越受到中西醫臨床重視。 毛宇湘教授以中醫理論為指導，并結合多年臨床實踐經驗，研制出由醋鱉甲、生牡蠣、赤芍、蜜紫菀等中藥組成的具有軟肝活血、開肺利水功效的復肝春3號方(FGC-3)，臨床療效顯著[2]。本研究擬通過觀察FGC-3對肝硬化腹水大鼠血清血管活性物質(NO、ET-1)、水通道蛋白AQP8水平的影響，以探索其利水機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠75只，體重(200±20 g)，購于河北省實驗動物中心，許可證號SCXK(冀2013-1-003)，合格證號1509127。實驗動物飼養于河北省實驗動物中心動物實驗室，使用IVC實驗動物飼養籠具，每籠3只，飼養溫度22～24℃，相對濕度40%～60%，每天明暗時間交替各12 h。普通全價顆粒飼料購自河北省實驗動物中心。飲水瓶、瓶塞、籠具均經滅菌處理，造模期間以15%食用酒作為飲料讓大鼠自由飲用，自由進食。實驗人員嚴格按要求進出實驗室并規范操作，妥善處理死亡動物，并做記錄。以上實驗動物飼養及操作條件均符合《實驗動物質量管理辦法》和《河北省實驗動物管理辦法》的要求。

1.1.2 實驗藥品 FGC-3顆粒劑由醋鱉甲2袋(批號1027064，相當于飲片20 g)、防己1袋(批號1027479，相當于飲片10 g)、澤蘭2袋(批號1027204，相當于飲片20 g)、赤芍1袋(批號1027457，相當于飲片10 g)、生白芍1袋(批號1017947，相當于飲片10 g)、蜜紫菀1袋(批號1024779，相當于飲片10 g)、當歸1袋(批號1027479，相當于飲片10 g)、生牡蠣1袋(批號1027079，相當于飲片20 g)、桔梗1袋(批號1005479，相當于飲片10 g)等藥組成，由廣東一方制藥有限公司提供。復方鱉甲軟肝片(批號0927236，內蒙古福瑞醫療科技股份有限公司，規格：0.5 g×48片，批準文號：國藥準字Z19991011)。

1.1.3 試劑及儀器 CCl4(天津市永大化學試劑公司)，橄欖油(上海德麗莎食品有限公司)，白酒(乙醇體積分數為50%) 石家莊酒廠，一抗(北京博奧森生物技術有限公司)，二抗、DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)，正常山羊血清、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(美國Invitrogen公司)，NO測試盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1試劑盒(美國Cloud-Clone Corp.公司)，全自動生化分析儀(日本HITACHI 7600型)，顯微鏡(日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11)，多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(美國Media Cybernetics)，酶標儀(美國BIO-TEK ELx800型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝硬化模型的建立及動物分組給藥 選取清潔級雄性Wistar大鼠75只，適應性喂養1周。隨機選取8只大鼠為空白對照組(N組)，標準飲食喂養14周后處死，留取標本。剩余大鼠用改良的CCl4-乙醇綜合法進行肝硬化腹水造模，經腹部皮下注射40% CCl4-橄欖油溶液，每4 d 1次，首次劑量為0.5 ml/100 g，從第2次開始注射劑量改為0.3 ml/100 g，每次注藥時嚴格測量體重，以15%乙醇(由上述白酒加蒸餾水配制，下同)作為飲料，飼料均為普通飼料，持續10周。通過查腹水征及腹腔診斷性穿刺確定41只大鼠存在腹水，隨機分為5組進行藥物治療，灌胃劑量為1 ml/100 g。模型組(M組，n=9)：灌服生理鹽水；FGC-3高劑量組(G組，n=8)：用FGC-3制劑灌胃，劑量為52 g/kg體重；FGC-3中劑量組(Z組，n=8)：用FGC-3制劑灌胃，劑量為26 g/kg體重；FGC-3低劑量組(D組，n=8)：FGC-3制劑灌胃，劑量為16.25 g/kg體重；復方鱉甲軟肝片組(F組，n=8)：用復方鱉甲軟肝片溶液灌胃，劑量為26 g/kg體重。每日1次，共4周。治療期間造模組仍以40% CCl4-橄欖油溶液按0.3 ml/100 g體重于大鼠腹部皮下注射，每周1次，至14周實驗結束，處死大鼠，留取標本。

1.2.2 取材 藥物干預1個月后，所有大鼠禁食12 h以上，稱重大鼠后摘眼球取血，收集約5 ml血液于無菌試管中，離心，分離血清，密封，-40℃凍存，以備血清ELISA檢測。頸椎脫臼法處死各組大鼠，剖開大鼠腹腔，抽取腹腔積液；觀察肝臟的顏色、質地，取大鼠肝組織，置于凍存管，并迅速將其低溫保存于液氮罐內，用于檢測AQP8。選取同一部位肝組織，浸泡于4%中性甲醛固定液中，以做HE染色切片。

1.2.3 觀察指標與方法 ①一般情況：觀察各組大鼠的精神狀態、活動度、皮毛色澤、飲食、二便、體重變化及死亡情況。②腹腔積液量：脫頸處死大鼠后，沿腹中線剪開3.0 cm，以無菌注射器抽取腹腔內液體，記錄腹腔積液量。③肝功能指標：以全自動生化儀檢測天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白蛋白(Alb)。④肝纖維化指標：放射免疫法測定透明質酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)。⑤血清NO：嚴格按試劑盒操作說明書用硝酸還原酶法測定其吸光度(OD)值。⑥血清ET-1：嚴格按試劑盒操作說明書用ELISA法定量測定其OD值。⑦免疫組化測定肝組織AQP8使用形態學圖像分析系統對照片進行分析，測定陽性反應物的積分光密度(IOD)值。

2 結果

2.1 一般情況 本實驗造模大鼠死亡率為20.9%，腹水形成率為61.19%。N組大鼠精神狀態良好，活動正常，皮毛、飲食、二便無明顯改變，體重逐漸增加。M組大鼠出現明顯的腹部脹大、精神萎靡、易驚、活動減少、皮毛干枯毛躁泛黃易脫落、飲食減少、尿量減少、大便灰白、體重先減輕后增加。第1～4周組大鼠體重逐漸下降10～30 g，第5周無明顯變化，個別大鼠體重下降約10 g，第6～10周約80%大鼠體重逐漸上升20～60 g。經治療，G、Z、D、F組大鼠上述情況均有不同程度改善，體重增加，其中G組大鼠改善最明顯，其次為Z組，D組、F組相比無明顯差異。

2.2 肝組織外觀形態的比較 肉眼觀察大鼠肝組織，N組肝臟質地好，色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，大小適中；M組肝臟質脆，色暗紅或褐色，表面凹凸不平，可見大小不等的結節，邊緣較鈍，體積變??；D組肝臟腫大、質脆，色褐色，表面粗顆粒狀，邊緣較鈍；G、Z、F組肝臟腫大，色深紅，表面尚光滑，可見不同程度細小顆粒狀區域，邊緣較銳利。

2.3 各組大鼠腹水量的比較 見表1。

表1 各組大鼠腹水量情況比較

2.4 各組大鼠肝功能指標情況 見表2。

表2 各組大鼠肝功能情況比較

2.5 各組大鼠肝纖維化指標 見表3。

表3 各組大鼠肝纖維化指標情況比較

2.6 FGC-3顆粒劑作用各組大鼠后對NO、ET-1、AQP8 IOD值的影響 見表4。

表4 各組大鼠NO、ET-1、AQP8 IOD值的比較

2.7 光鏡下觀察 見圖1。 N組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態正常，圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見炎癥、變性或壞死等病理改變。M組多數正常肝小葉結構明顯破壞，出現廣泛的變性、出血、炎癥等病理改變，典型假小葉廣泛形成。與M組比較，各治療組肝臟結構均見不同程度減輕，G組最明顯。G組肝小葉結構輕度破壞，可見纖維組織增生，未見假小葉，脂肪變性消失，肝細胞輕微充血腫脹，較少炎性細胞浸潤。Z組可見纖維間隔減少，少量假小葉形成，脂肪變性基本消失，可見少量炎性細胞浸潤。D組肝小葉結構破壞，假小葉形成明顯，可見大量炎性細胞浸潤，可見變性、出血等病理改變，較M組有改善，但程度不明顯。F組肝小葉結構中度破壞，部分假小葉形成，可見炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠的肝臟病理(HE染色)

3 討論

我國是慢性病毒性肝炎大國，僅慢性乙型肝炎病毒感染者就達9 300萬人；且隨著人們生活條件的改善，酒精性肝病、脂肪性肝病的患病率日益增高；大氣環境的改變，藥物的不合理應用導致的藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、隱源性肝炎的患病率也逐漸升高，這些肝臟疾病均可導致肝細胞發生變性、壞死、再生，反復進行，進而導致肝臟彌漫性纖維化、再生結節和假小葉形成，發展為肝硬化[3]。 肝硬化是消化系統的常見病，年發病率為17/100 000，且多見于20～50歲的男性，其中城市男性50～60歲的患病者的病死率高達112/100 000，我國肝硬化患者大多數為肝炎后肝硬化，少部分為酒精性肝硬化和血吸蟲性肝硬化。有資料表明，腹水形成后1年死亡率15%，2年死亡率44%，5年生存率為14%～88%[4]。因此對肝硬化腹水形成機制的研究一直是臨床研究的熱點、難點，其對指導臨床用藥，進而改善肝硬化腹水患者生活質量及壽命有重要意義。

現代醫學認為肝硬化腹水的形成是門靜脈高壓和肝功能減退共同作用的結果，其過程復雜，可涉及多種因素，主要有門靜脈壓力增高、血漿膠體滲透壓下降、神經體液因素、肝腸淋巴液形成增多而漏入腹腔形成腹水等[5]。一方面，肝硬化時會出現全身血流動力學的變化，形成心輸出量增加、低外周血管阻力的高動力循環狀態，目前多數學者認為，這是由于肝功能減退和側支血管開放，使得肝臟對部分血管活性物質(如NO、ET)滅活減少所致。這些血管活性物質可能介導了肝硬化門靜脈高壓癥高動力循環狀態的形成、維持和發展過程，參與了腹水的形成[6,7]。另一方面，則是與某些體液因素相關，如抗利尿激素、AQP等。AQP是一組對水有高選擇性的細胞跨膜轉運蛋白，是跨膜水轉運的重要通道[8]。肝細胞上有多種AQPs，其中以AQP8的表達最高。AQP8表達缺乏可能導致肝細胞損傷、水液代謝失調，從而引起肝硬化、腹水等相關疾病的發生[9]。

肝硬化腹水，屬于中醫“鼓脹”范圍。諸多醫家將鼓脹的病因歸結于酒食不節、情志刺激、蟲毒感染、病后續發四個方面，其病機為肝、脾、腎受損，氣滯、血瘀、水停腹中。病理因素不外乎氣滯、血瘀、水濕，三者各有側重，又相互為因，錯雜為病。對其治療，歷代醫家多從肝脾腎論治。病性總屬本虛標實，表示為主者當根據氣、血、水的偏盛，分別采用行氣、活血、祛濕利水或暫用攻逐之法；本虛為主者，當根據陰陽的不同，分別采取溫補脾腎或滋養肝腎法，同時配合行氣活血利水，以補虛不忘實，瀉實不忘虛為原則[10]。毛宇湘教授結合多年治療肝硬化腹水的臨床經驗，提出肝硬化腹水從肺論治的理論，這是由肺的生理特性和生理功能決定的。肺為華蓋，為水之上源，主通調水道，通過肺的宣發肅降實現；肺主氣，人體的整個水液代謝過程，也都要依賴于氣的推動而完成。《素問·經脈別論篇》中有云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行……”，強調肺在水液疏布方面的作用。相對應的肝硬化腹水的治療原則即為宣肺利水，《素問·湯液醪醴論》中有“平治于權衡，去宛陳莝……開鬼門，潔凈府”的論述，此處的開鬼門，即為宣肺利水。

在此理論指導下，毛宇湘教授結合多年治療肝硬化腹水的臨床經驗，提出頑固性肝硬化腹水從肺論治的思路，并研制出具有軟肝活血、開肺利水功效的復肝春3號方，方中醋鱉甲、生牡蠣為君，軟肝為本，二者均入肝經血分，味咸，咸能軟堅散結。肝為血臟，體陰用陽，且血瘀是肝硬化腹水中的一個重要病理因素，故用當歸、白芍養血柔肝，赤芍等活血化瘀；又肺為水之上源，主通調水道，故用桔梗、蜜紫苑開肺氣，理三焦，通調水道，共為臣藥。澤蘭、防己等利水消腫，為佐使藥。本研究顯示FGC-3可明顯改善肝硬化腹水大鼠的一般情況，減少腹腔積液量，減輕肝組織炎癥及肝纖維化程度，降低模型大鼠血清NO、ET-1水平，提高肝硬化腹水大鼠AQP8的表達，可能是其利水的作用機理。