不同程度非酒精性脂肪性肝病患者血清炎癥因子及免疫因子表達的研究*

羅 娟 閆再宏 梁慧霞

河北中石油中心醫院消化內科 (河北 廊坊， 065000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是臨床常見的肝病，包括非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、脂肪性肝炎(NASH)及NAFLD相關的肝纖維化及肝硬化，NASH是引起肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的獨立危險因素，早期確診、早期治療可延緩肝纖維化、肝硬化及惡變進程[1]。因此在臨床工作中對NAFL與NASH的鑒別診斷非常重要，肝活檢是目前鑒別診斷NAFL和NASH的金標準，但其屬于有創操作，技術要求高，且存在致命性并發癥風險，因此具有一定的局限性，未能在基層醫院普及開展[2]。

臨床上需要尋找其他更安全、簡便的方法來診斷、區分NAFL和NASH。NAFLD的發病機制比較復雜，已有的研究認為遺傳易感性、免疫功能紊亂、脂質代謝異常、氧化應激、內質網應激、細胞因子、內毒素等均參與病情進展[3]。故本研究旨在通過觀察不同程度NAFLD患者血清中炎癥因子及免疫因子的表達，探討血清炎癥因子及免疫因子在NAFLD病情診斷中的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年1月在我院治療的NAFLD患者80例(NAFLD組)，根據脂肪肝程度分為：輕度患者25例，中度患者31例，重度24例。納入標準：①診斷符合《非酒精性脂肪肝病防治指南(2018年更新版)》中的標準[4]；②無病毒性肝炎、藥物性肝炎等其他肝臟疾病者；③患者簽署知情同意。排除標準：①有精神疾病史者；②患者合并有惡性腫瘤、糖尿病、內分泌疾病等其他疾病。同時選取健康體檢者80例作為對照組，兩組人群一般資料比較見表1。

表1 兩組人群一般資料比較

1.2 檢查方法 所有研究對象均于清晨抽取空腹靜脈血，分為兩份，一份在4℃條件下以轉速3 500 r/min離心10 min，取血清采用流式細胞學檢測IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平。經包被、加酶標抗體、加底物顯色、終止后在相應波長處檢測吸光度，代入標準曲線計算含量。檢測儀器：美國伯騰公司ELX800多功能酶標儀，試劑盒生產廠家：上海酶聯生物科技有限公司。一份采用流式細胞術檢測CD4+、CD8+和CD4+CD25+，靜脈血以EDTA抗凝，加入紅細胞裂解液室溫孵育15 min，PBS洗滌2次。加入抗人抗體TITC-CD4、PE-CD8、APC-CD25，于4℃反應40 min。加入固定劑室溫孵育15 min，PBS洗滌1次。加入穿透劑、抗人抗體PE-Foxp3，于4 ℃反應40 min。檢測前用校準熒光微球校正儀器，采用CellQuest軟件分析結果。檢測儀器：美國貝克曼庫爾特AQUIOS CL流式細胞儀。

2 結果

2.1 兩組人群血清炎癥因子、免疫功能比較 NAFLD組患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+明顯高于對照組(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+明顯低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組人群血清炎癥因子、免疫功能表達水平比較

2.2 不同程度NAFLD患者血清炎癥因子、免疫功能比較 不同程度NAFLD患者性別、年齡及吸煙比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。重度NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+表達水平明顯高于輕度和中度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表達水平明顯低于輕度和中度患者(P<0.05)；中度患者IL-17和IL-18表達水平明顯高于輕度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表達水平明顯低于輕度和中度患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同程度NAFLD患者血清炎癥因子、免疫功能比較

2.4 NAFLD組患者血清炎癥因子、免疫指標與疾病嚴重程度相關性分析 將NAFLD組患者血清炎癥因子、免疫指標與疾病嚴重程度進行Spearman相關分析，結果顯示：IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α、CD4+表達水平與疾病嚴重程度呈正相關(rs=0.565、0.532、0.311、0.304和0.321，P<0.05)，CD8+和CD4+CD25+與嚴重程度呈負相關(rs=-0.511和-0.503，P<0.05)。

3 討論

NAFLD以彌漫性肝實質細胞脂肪變性、脂肪蓄積為病理特征，多數患者早期無明顯癥狀，偶見消化不良、肝區隱痛、肝脾腫大等非特異性癥狀或體征[5]。NAFLD的發生與不合理的飲食結構密切相關，近年來其發病率呈現逐漸升高的趨勢，已逐漸發展為常見的慢性肝臟疾病，如不及時給予干預，可逐步進展至肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌等嚴重病變階段[6]。在臨床工作中，應注意區分NAFL和NASH患者，但目前尚缺乏安全、操作簡便、價格低廉的診斷方法[7]。

NAFLD的發病機制復雜，目前公認的學說是“二次打擊”， 第一次打擊是由于高甘油三酯血癥導致的肝細胞脂肪浸潤，導致胰島素抵抗。第二次打擊是多余的脂肪導致炎癥、纖維化、細胞壞死，氧化應激、內質網應激、炎癥細胞因子、內毒素參與這一過程[8，9]。因此炎癥因子、免疫指標可能對NAFLD病情具有一定的提示作用[10]。TNF-α是由脂肪組織中巨噬細胞分泌的炎癥因子，可引起外周胰島素抵抗，并能刺激激素敏感性脂肪酶，導致游離脂肪酸水平升高[11]。在肝臟中TNF-α由Kupffer細胞產生，通過toll樣受體介導脂肪肝的發生。IL-17是由CD4+和 CD8+T淋巴細胞產生，啟動炎癥級聯反應[12]。動物實驗已經證實，IL-17與肝臟脂肪變性、NAFLD的發生相關，促進NAFLD從單純性脂肪變性向NASH的轉變[13]。IL-18是由巨噬細胞、Kupffer細胞、內皮細胞合成的炎癥因子，可誘導趨化因子、粘附分子和其他促炎細胞因子的產生，可與內毒素協同誘導肝臟損傷，導致肝臟炎癥、纖維化和壞死[14]。IL-22 的靶器官是肝臟，與急性期蛋白、組織修復相關蛋白質表達的誘導有關[15]。

本研究發現，NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明顯高于健康體檢者，NAFLD重度患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明顯高于輕度和中度患者；IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平與NAFLD嚴重程度呈正相關。這一結果提示，可將IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α等指標作為NAFLD診斷和病情評估的潛在輔助指標。這是由于NAFLD病變可導致脂肪組織中的炎癥細胞分泌大量的炎癥因子，可引起胰島素抵抗、肝細胞炎性損傷。在這一病變過程中啟動一系列炎癥級聯反應，引起IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平升高，其肝臟炎性損傷越嚴重，上述炎癥指標水平越高。

NAFLD的發生、發展過程伴隨著免疫微環境的變化，CD4+、CD8+T淋巴細胞、調節性T細胞CD4+CD25+表達異常可能是其病理機制之一[16]。本研究發現，NAFLD患者CD4+水平明顯高于健康體檢者，而CD8+和CD4+CD25+水平明顯低于健康體檢者。NAFLD重度患者CD4+水平明顯高于輕度和中度患者，而CD8+和CD4+CD25+水平明顯低于輕度和中度患者。CD4+水平與NAFLD嚴重程度呈正相關，CD8+和CD4+CD25+水平與NAFLD嚴重程度呈負相關。這一結果提示，可將CD4+、CD8+和CD4+CD25+等指標作為NAFLD診斷和病情評估的輔助指標。這是由于CD4+T淋巴細胞是機體免疫應答的 主要反應細胞，可增強其他免疫細胞功能。CD8+T淋巴細胞對靶細胞產生細胞介導的細胞毒作用，并調節性抑制CD4+T淋巴細胞，兩者的穩定比例維持細胞免疫平衡。NAFLD患者CD4+T淋巴細胞比例升高、CD8+T淋巴細胞比例下降而引起機體免疫紊亂狀態。CD4+CD25+可通過分泌抑制性細胞因子、抗氧化應激、調控Th1/Th2平衡等途徑維持機體免疫穩態，延緩NAFLD病程進展，其水平的下降可加重免疫紊亂狀態。

基于炎癥反應和免疫反應在NAFLD病變過程中的重要作用，本研究選擇血清炎癥因子IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和免疫指標CD4+、CD8+和CD4+CD25+為指標，發現NAFLD患者血清炎癥因子及免疫指標異常，與患者嚴重程度存在一定相關性。今后可將其作為診斷和評估NAFLD病情的輔助指標。但本研究并未能篩選上述指標聯合檢測的特異性和敏感性，尚存在一定的不足，在今后的工作中可進一步探討指標聯合檢測的意義。