基于ITS2序列的鉤藤屬藥用植物的分子鑒定

王江瑞，談利紅，熊可慧，姜理華*，唐倩（. 江蘇知原藥業股份有限公司，江蘇 無錫 494；. 重慶醫藥高等專科學校，重慶 40；. 國家衛生健康委能力建設和繼續教育中心，北京 00044）

中藥材鉤藤為茜草科鉤藤屬的多基源植物，《中國藥典》2020年版中將鉤藤（Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil）、華鉤藤（Uncaria sin-ensis（Oliv）. Havil.）、大葉鉤藤（Uncaria macrophyllaWall.）、毛鉤藤（Uncaria hirsuteHavil.）以及無柄果鉤藤（Uncaria sessilifructusRoxb.）收錄于鉤藤項下，其藥用部位均為干燥帶鉤的莖枝[1]。除此之外，市場上的商品鉤藤種類十分混亂，除藥典規定的外還摻有攀莖鉤藤[Uncariascandens（Smith）Hutchins.]等其他鉤藤屬植物。對于中藥材的鑒定，一般采用性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定等傳統手段[2]，由于鉤藤屬植物其化學性質、外觀性狀都差異不大，因此很難運用傳統手段將其區分。近年來，分子生物學技術不斷發展，并在中藥材鑒別領域得到了廣泛的運用[3-9]，本文采用DNA條形碼技術對藥典中鉤藤屬植物及其混偽品進行測序并構建其發育樹，并與GenBank中現有鉤藤屬植物的ITS2序列進行對比歸類，從而從分子遺傳學上對其進行鑒別，為鉤藤屬植物的鑒別提供依據。

1 材料

Allegra X-30R Centrifuge離心機（BECKMAN COULTER公司）；凝膠電泳成像系統、iCycleriQ Multi-Color Real-Time PCR儀（BIO-RAD公 司）；全自動進樣品快速球磨儀（上海凈信實業發展有限公司）；dNTP，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）；植物DNA提取試劑盒（ThermoFisher）；通用引物ITS2F/ITS3R由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

本研究所用的鉤藤來自云南、四川、廣州等地，包括6個物種31個樣品，具體信息見表1。實驗室樣品經重慶醫科大學中醫藥學院王剛教授鑒定為茜草科Rubiaceae植物鉤藤的干燥帶鉤莖枝。

表1 藥材及其來源Tab 1 Medicinal materials and their source

2 方法與結果

2.1 DNA提取

取鉤藤新鮮葉片各約30 mg，加入2 mL液氮，用DNA快速球磨儀研磨5 min（30次·s－1），用植物DNA提取試劑盒提取總DNA，沉淀劑為三氯甲烷[10]，其余步驟均按照試劑盒說明書進行。

2.2 PCR擴增及測序 PCR擴增正向引物ITS2F為5'＞ATGCGATACTTGGTGTGAAT＜3'，反向引物ITS3R為5'＞GACGCTTCTCCAGACTACAAT＜3'。PCR反應體系為25 μL，包括2×Easy Taq PCR Super Mix（Trans Gen Biotech Co.）12.5 μL，2.5 μmol·L－1正反引物各1.0 μL，模板DNA為2 μL，ddH2O為8.5 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，退火溫度為56℃，30 s；72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸10 min。反應結束后取5 μL反應產物，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，觀察到條帶單一，表明PCR擴增良好（見圖1），再將擴增好的DNA送至華大基因科技有限公司進行雙向測序。從PCR擴增圖可以看出，鉤藤屬植物的ITS序列長度約在500～750 bp，并且不同種之間序列長度差異較小。

圖1 樣品PCR擴增結果Fig 1 PCR amplification results of samples

2.3 序列數據處理與提交

利用CodonCode Aligner V 6.0.2對測序峰圖進行校對拼接，除去引物區?；陔[馬爾夫模型的HMMer注釋方法將所有測得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去兩端的5.8 S和28 S區，從而獲得內部轉錄間隔區ITS2序列。再利用MEGA6.0進行序列的分析比對，并計算K2P遺傳距離，建立NJTree。

2.4 聚類分析

通過MEGA 6.0軟件，基于各個鉤藤的ITS2序列，構建NJTree（見圖2，支上數值僅顯示自展支持率≥50%），從圖中可以看出，鉤藤屬6個種17個樣本各聚為一類，并依次與GenBank中鉤藤屬的各個種相聚為一類，表現出單系性，與其他同屬植物之間可以明顯地區分。再者，華鉤藤與鉤藤親緣關系較藥典收載的其他鉤藤更近，這與朱爽等[11]分析的結果一致。因此，ITS2序列作為DNA條形碼可準確快速地鑒別鉤藤屬及其近緣物種。

圖2 基于ITS2序列構建的鉤藤屬NJTree（boot strap score 1000 replicates）Fig 2 NJTree of Uncaria Schreber nom. cons. based on ITS2 squence

2.5 鉤藤屬ITS2序列特征

本研究比較了鉤藤屬6個種17個樣品，其ITS2序列長度在220～224 bp，大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤、無柄果鉤藤以及攀莖鉤藤相對于鉤藤在ITS2序列上各出現11、4、3、13和8個變異位點；與下載于GenBank上的鉤藤屬標準藥材進行比對，并應用MEGA 6.0軟件以Kimura 2-parameter（K2P）計算遺傳距離，其鉤藤屬種內遺傳距離為0～0.020，構建其NJTree可以明顯區分鉤藤與攀莖鉤藤。

3 結論與討論

鉤藤是我國傳統中常用的息風止痙類中藥，其茜草科鉤藤屬植物在全世界約有70多種，我國約有14多種，其物產資源豐富[12]，而《中國藥典》中只收載了5種鉤藤屬植物，市場上銷售的鉤藤藥材較為混亂，僅靠傳統手段難以區分，為了正本清源以及有效快速準確鑒定鉤藤屬植物，本研究運用了DNA條形碼技術來對其進行鑒別。結果表明運用ITS2序列能明顯區別藥典中收載的5種鉤藤植物及攀莖鉤藤，同時根據構建的系統聚類樹也能很清楚地將其區分。DNA條形碼技術是近年來國際上發展起的新的生物物種鑒定技術，應用DNA分子標記技術對中藥材原植物進行鑒定已成為研究的熱點[13-18]，DNA條形碼技術因其不受外界因素、生物發育階段或器官組織的影響，為基因水平的鑒定提供了一定的基礎，并且中藥材的DNA分子標記技術都是以ITS2序列為主，以psbA-trnH為補充序列來對其進行鑒定。

本研究分別從不同地區收集6種鉤藤屬樣品，并進行基因組DNA提取，ITS2 區序列擴增，序列測定與分析，以及采用MP構建該鉤藤樣品在其近緣種之間的NJTree樹，從圖中可以看出樣品華鉤藤與GenBank數據庫中已有的華鉤藤（KX675015）聚為一支，支持率達到95%，然后又與鉤藤聚為一支；樣品大葉鉤藤、無柄果鉤藤以及毛鉤藤單獨聚為一支，支持率分別達到96%、99%及87%。由此可見，從分子生物學和遺傳學的角度分析，各個鉤藤屬樣品與GenBank數據庫中相應鉤藤相對應，并聚為同一支，并且可以很好地區分各個鉤藤屬相近的物種。

因此，采用DNA分子技術——ITS2序列能更加準確、高效、快速地用于植物物種之間的鑒別，為鉤藤藥材以及其他藥用植物的真偽鑒別提供有效的手段，同時為藥品監管部門提供可靠手段。