槐花散中側柏葉的遵古炮制及現代炮制方法比較研究

于浩，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 6600；3. 遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連6600）

經典名方遵古開發相關研究已成為研究熱點，已有較多文獻從本草考證、制劑工藝、專利研究等方面展開相關研究。但有關經典名方中具體中藥炮制方法的研究鮮有報道。本課題組在“遵從經典，符合藥典”的原則下，采用性狀鑒別、浸出物含量、化學成分、指紋圖譜相似度評價等多種分析方法比較經典名方槐花散中側柏葉古法炮制與現代炮制方法的異同點，結合多波長融合指紋圖譜，從化學成分方面驗證古今炮制方法的異同。

槐花散由炒槐花、焙側柏葉、荊芥穗、麩炒枳殼組成，具有疏風利氣、清腸涼血的功效，主治腸風臟毒下血、痔瘡出血、脫肛屬風邪熱毒或濕熱等病癥[1]。經方組成中側柏葉起涼血止血之功效，側柏葉藥材的基原與藥用部位與2020年版《中國藥典》收載品種相同，選用柏科植物側柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和葉，多在夏、秋二季采收，陰干[2]。側柏葉最早記載于《神農本草經》，微寒，能涼血止血、清熱止咳、祛風利濕、散腫毒、生發烏發[3]。焙是古代炮制方法之一，將藥物置于器皿中，用文火經較短時間加熱至藥物顏色加深、質地酥脆為度。焙制側柏葉在《圣濟總錄》和《普濟方》中皆有記載[3-4]。本研究還原古籍中記載，以焙制側柏葉為基準，采用烘制方法，比較烘制側柏葉與焙制側柏葉的異同點。

1 材料

1.1 試藥

側柏葉藥材（上元堂藥房，產地為安徽省，經遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為柏科植物側柏的干燥枝梢和葉）。乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），水為超純水。

1.2 儀器

2 L 陶瓷藥罐（壺福有限公司）；1260 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和 OpenLAB CDS色譜工作站）；LY15-101-2電熱恒溫干燥箱（上海龍躍儀器有限公司）；JX-2020小型珠磨儀（上海凈信有限公司）；KQ5200V超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 不同炮制方法樣品性狀鑒別

2.1.1 焙制側柏葉的制作 取干燥后側柏葉，除去硬梗及雜質，置于陶瓷藥罐內，用文火加熱，至罐中側柏葉顏色變深，質地酥脆，有香氣散出。取出，晾干，得側柏葉焙制樣品（見圖1）[4-6]。

圖1 不同炮制方法的側柏葉性狀鑒別Fig 1 Characteristics of cacumen platycladi by different processing methods

2.1.2 烘制側柏葉的制作 取干燥后側柏葉，除去硬梗及雜質，置于烘箱中，采用均勻設計法，烘箱溫度為120、140、160、180℃，烘制時間為10、15、20 min。取出，晾干，得不同條件下側柏葉烘制樣品。

2.1.3 性狀鑒別及浸出物含量測定 對不同炮制方法的側柏葉樣品進行性狀鑒別和浸出物含量測定。按2020年版《中國藥典》規定方法，照醇溶性浸出物測定法下的熱浸法測定，用乙醇作溶劑，測定不同炮制側柏葉樣品的浸出物含量，結果見表1。

表1 不同炮制方法樣品的鑒定Tab 1 Identification of samples of different processing methods

2.2 側柏葉UPLC指紋圖譜的建立[7-8]

2.2.1 色譜條件 Agilent Proshell 120 SB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），A為0.1%甲酸水，流動相 B為乙腈，梯度洗脫條件（0～2 min，5%～15%B；2～6 min，15%～18%B；6～18 min，18%～38%B；18～21 min，38%～54%B；21～27 min，54%～64%B；27～30 min，64%～85%B），進樣量5 μL，流速0.6 mL·min－1，柱溫30℃。

2.2.2 供試品溶液的制備 取炮制后側柏葉粉末約0.5 g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液20 mL，超聲處理20 min，用甲醇補足失重，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果各色譜峰相對保留時間RSD＜0.1%，相對峰面積RSD＜1.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 取相同炮制方法的側柏葉供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.1%，相對峰面積RSD均＜1.5%，表明方法重復性良好。

2.2.5 穩定性試驗 取供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h分別按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果各共有色譜峰相對保留時RSD＜0.1%，相對峰面積RSD＜1.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.6 多波長融合側柏葉的UPLC指紋圖譜的建立 選取140℃烘制樣品與焙制樣品，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，共確認了21個共有峰。通過DAD檢測器對側柏葉色譜圖進行紫外全波長（200～400 nm）掃描。根據掃描結果確定融合波長為254、280、300 nm。分別從Agilent 1260色譜工作站中導出254、280、300 nm的dif格式數據文件，使用Matlab軟件編程，將導出的數據進行全時段多波長信息融合后，比較得出焙制側柏葉與烘制側柏葉在色譜圖上無顯著性差別，結果見圖2。

圖2 側柏葉焙制品（S1：B1、B2、B3混合樣品）與烘制品（S2：H1、H2、H3混合樣品）多波長融合的UPLC指紋圖譜Fig 2 UPLC multi-wavelength fusion fingerprint of cacumen platycladi baked product（S1：B1，B2，B3 mixed samples）and dried product（S2：H1，H2，H3 mixed samples）

2.3 不同炮制方法的側柏葉樣品同異性分析

將不同炮制方法的側柏葉共有峰峰面積數據導入SIMCA-P 14.1中進行無監督模式的PCA-X，獲得相應的模型，模型參數R2X（在 X 軸方向模型的解釋率）為0.748，Q2（模型預測率）為0.649，均＞0.5，表明該模型穩定可靠，見圖3。結果表明3批焙制側柏葉處在同一區間，且相鄰距離很小，焙制側柏葉樣品穩定性較好；不同烘制側柏葉處在不同區間，表明烘制側柏葉樣品隨不同烘制溫度受熱具有一定變化，可能與側柏葉的寒涼性有關。通過PCA-X判別可以直觀地顯示不同炮制方法側柏葉樣品之間的異同性，其中與焙制側柏葉最相近的烘制側柏葉方法為“2.1.3”項下H5條件（即140℃烘制15 min）。

圖3 不同炮制方法的側柏葉共有峰PCA-XFig 3 Lateral cypress PCA-X of cacumen platycladi by different processing methods

2.4 兩種炮制方法相似度評價

為了驗證烘制側柏葉與焙制側柏葉炮制方法的一致性，按照“2.1.3”項下H5條件制備10批樣品（編號為HZ1～HZ10），按照B1條件制備10批樣品的（編號為BZ1～BZ10），將所得樣品的UPLC色譜圖分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2014版）軟件，設定參照圖譜和時間漂移值0.2 min，用中位數法譜峰自動匹配，生成UPLC指紋圖譜共有模式，即對照指紋圖譜。結果烘制側柏葉與焙制側柏葉樣品對照指紋圖譜的相似度在0.96～0.99，說明烘制樣品與焙制樣品有較好的一致性，結果見圖4。

圖4 焙制側柏葉對照指紋圖譜（A）與烘制側柏葉對照指紋圖譜（B）Fig 4 Baked cacumen platycladi control fingerprints（A）and dried cacumen platycladi control fingerprints（B）

3 討論

本研究對烘制與焙制的側柏葉指紋圖譜進行多波長融合，融合后的指紋圖譜能夠完整地表征側柏葉的化學成分組成。運用主成分分析技術，將經典名方槐花散中古籍記載的焙制側柏葉與現代炮制工藝烘制的側柏葉進行分析，發現在140℃烘制15 min，得到的樣品與焙制樣品具有高度一致性。通過中藥指紋圖譜相似度評價系統，結果表明該條件下烘制側柏葉與焙制側柏葉的UPLC指紋圖譜相似度均在0.96～0.99，且兩種炮制方法生成的對照指紋圖譜基本相同，進一步驗證了現代烘制側柏葉可以代替古籍中記載的焙制側柏葉。

《古代經典名方關鍵信息考證原則》[9]中指出“信息考證在遵古的基礎上充分考慮當前臨床和生產實際，傳承不泥古，用歷史和發展的角度去認識經典名方中藥物炮制等關鍵共性問題”。本研究在烘制側柏葉過程中，利用烘箱、干燥室等使樣品受熱均勻，操作較為簡單，炮制方法僅與儀器的溫度、加熱時間有關，不需要考慮火候及操作經驗，只需要制訂炮制標準即可，解決了焙制側柏葉產量低、焙制火候難以控制、側柏葉化學成分熱不穩定性、焙制樣品差異性對藥效產生影響等問題。本研究發現不同烘制溫度的側柏葉樣品之間具有明顯差異，側柏葉屬寒涼類藥物，其中的槲皮苷、異槲皮苷、楊梅苷等黃酮苷類均與寒涼之性明顯相關[10-16]，研究表明側柏葉隨受熱溫度升高，穗花衫雙黃酮、扁柏雙黃酮含量下降，山柰酚、楊梅素含量增加[17-18]。

本研究表明用烘制側柏葉代替古籍中記載的焙制側柏葉，既遵從了古代炮制制藥技術理念又便于控制炮制程度，既降低了勞動成本和炮制工藝的繁瑣性又能復刻藥效，體現了中藥現代炮制方法的科學性。