基于HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路探討油桐花水提物對燙傷大鼠的作用機制

彭健，王永萍，劉欣（貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴陽 550002）

燒燙傷是指人們在生活或工作中被沸水、油燙傷，或者是被火、電、化學藥物等灼燒，引起皮膚起泡或深層組織感染、潰爛、形成瘢痕的外傷病[1]。研究表明，缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factors-1α，HIF-1α）、Beclin1蛋白及微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表達與燙傷病理發展密切相關。HIF-1α是感應細胞內氧氣濃度的最敏感因子，細胞缺氧程度常用HIF-1α的表達表示，且與自噬表達程度密切相關[2-3]。燙傷后HIF-1α表達增多，使大量Beclin1蛋白質釋放形成自噬泡，誘導大量LC3-Ⅱ合成，導致自噬水平上升[4-6]。Beclin1、LC3-Ⅱ是反映自噬活性的標志性蛋白。中醫認為燒燙傷屬于“火毒、熱毒”，常因火毒熱氣內攻，致皮肉潰爛，加重病情[7]。油桐為落葉性喬木，屬大戟科油桐屬，油桐花是薔薇亞綱，大戟科植物油桐[Vernicia fordii（Hemsl.）Airy Shaw]的花，主產于我國南方地區，油桐全株皆可入藥，但其根、皮、葉、果實均有毒，臨床應用很少。油桐花毒性較小，歸肺、心經，具有促進傷口愈合、消腫、鎮痛、止血、麻醉等作用[8]，古人早已用其治療燒燙傷，療效顯著。本實驗擬通過油桐花水提物調控HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路的表達來研究油桐花治療燙傷的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質量（150±15）g [長沙天勤生物公司，動物許可證：SCXK（湘）2019-0013；實驗動物合格證編號：No.1107262011001163]。

1.2 試藥

硫化鈉（批號：20191210，國藥集團），濕潤燒傷膏（批號：13923911455，汕頭美寶制藥），蘇木素染液（批號：C200301）、伊紅染液（批號：C200403）（珠海貝索生物），Beclin1、HIF-1α、LC3-Ⅱ ELISA試劑盒（批號分別為ml059015、ml003167、ml059507，上海酶聯生物）。Beclin1、HIF-1α、LC3B抗體（批號分別為11306-1-ap、AF1009、AF5402，Affinity）。β-actin抗體（批號：AC026，Abclonal），生物素化山羊抗兔IgG（H＋L）（批號：ab6721，英國Abcam）。Prime Script RT reagent Kit（貨號RR047A，寶日生物）。

1.3 儀器

QE-300目中藥粉粹機（浙江屹立），DRHH-S8型恒溫水浴鍋（上海雙捷），CTP0011型電子天平（上海友聲衡器），YLS-5Q型燙傷儀（山東益延科技），KD-BM型包埋機（浙江金華科迪），YD-335型石蠟切片機（浙江金華設備廠），JY-SCZ4＋型垂直電泳槽（北京君意公司），5200型化學發光凝膠成像儀（上海天能科技）。

1.4 藥材

新鮮油桐花采自四川省峨眉山市黃灣鎮，花和蒂一并采摘，由貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為正品。日光下曬干，用粉碎機粉碎，裝入密封塑料袋，備用。前期課題組研究證明油桐花不同溶劑提取物均有一定的抗炎作用，但以水提物抗炎鎮痛作用更明顯[9]，因此本實驗采用油桐花水提物進行后續研究。

2 方法

2.1 油桐花水提物制備

精取油桐花粉末30 g，裝入盛有300 mL蒸餾水的圓底燒瓶，浸泡30 min，恒溫水浴鍋加熱回流2 h，紗布過濾3次，并將紗布中殘留的液體壓出，即得油桐花水提物，質量濃度為0.1 g·mL－1（即低劑量0.33 g·kg－1）。將油桐花水提物倒入蒸發皿中，電爐加熱濃縮，制得質量濃度為0.6 g·mL－1、0.3 g·mL－1的油桐花水提物（即高劑量2 g·kg－1，中劑量1 g·kg－1[8]）。

2.2 動物造模及給藥

參考課題組前期研究[9-10]，大鼠隨機分為正常組（n＝10）和造模組（n＝50），適應喂養7 d。20%硫化鈉脫背毛，24 h后造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛，充分麻醉后標記燙傷位置，為兩耳連線中點后5 cm。YLS-5Q控溫燙傷儀設置溫度120℃，實際溫度約90℃，3#燙頭（2.5 cm2）緊貼皮膚燙傷18 s。燙傷前設置空調溫度26℃，防止大鼠體溫過低而死亡。燙傷3 d后，隨機選取模型大鼠1只剪取燙傷全層皮膚，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色對比。造模成功病理切片可見表皮和真皮大面積壞死，皮下肌纖維變性壞死，炎性細胞浸潤，出血等一系列病理改變（見圖1）。造模成功后再分為模型組，陽性組（濕潤燒傷膏組），油桐花水提物高、中、低劑量組，每組10只，用記號筆標記。油桐花水提物各劑量組分別用棉簽蘸取油桐花水提物2、1、0.33 g·kg－1對大鼠創面進行均勻涂抹。陽性組用棉簽蘸取濕潤燒傷膏均勻涂抹，劑量0.13 g·kg－1，連續21 d，1次·d－1。正常組和模型組不給藥。

圖1 大鼠造模前后皮膚組織形態學變化（HE，200×）Fig 1 Histomorphological change of the rat skin before and after modeling（HE，200×）

2.3 取材

用藥21 d后對各組大鼠背部進行圖片采集。股靜脈取血，3000 r·min－1離心15 min，取上清液，于－80℃保存。剪取正常組皮膚及各燙傷組燙傷全層皮膚組織，一半放入4%多聚甲醛固定，另一半于－80℃儲存，備用。

2.4 指標檢測

藥物干預21 d后，油桐花水提物對燙傷大鼠創面愈合的影響可用創面大體圖片、面積及損傷皮膚HE染色來評價。用ELISA法檢測血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ的濃度水平，蛋白質印跡法、免疫組化檢測皮膚HIF-1α、Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白質表達水平。

2.5 統計學分析

使用SPSS 25.0統計分析，數據以±s表示，采用組間均數比較的方法ANOVA，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠燙傷創面的影響

燙傷大鼠創面恢復圖片見圖2，與模型組比較，不同劑量油桐花水提物和濕潤燒傷膏對大鼠燙傷創面恢復有明顯效果，傷口明顯減小。

圖2 油桐花水提物對燙傷大鼠創面的影響Fig 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on scalded wound in scalded rats

3.2 大鼠皮膚組織形態學變化

大鼠皮膚HE染色顯示，正常皮膚組織表皮結構完整清晰，角化層明顯，復層扁平上皮層較薄，細胞排列整齊緊密；真皮內膠原纖維排列整齊，胞質紅染、均勻；皮下脂肪層及肌層結構清晰可見，脂肪細胞及肌纖維排列整齊、致密，體積大小均一，細胞核形態正常。模型組皮膚有大批纖維組織增生及炎性細胞，大批皮下組織變性、壞死。與模型組相比，陽性組和高劑量組皮膚組織損傷區域可見部分膠原纖維交錯排列和較多的纖維細胞，少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，提示皮膚組織損傷修復程度相對最好；低劑量組和中劑量組皮膚組織損傷區域可見較多的纖維細胞，炎性細胞較少，提示皮膚組織損傷修復程度相對較好（見圖3）。

圖3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織病理變化的影響（HE，400×）Fig 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the pathological change of the skin tissue in scalded rats（HE，400×）

3.3 免疫組化檢測結果

與正常組相比，模型組大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性組，油桐花水提取物高、中劑量組大鼠皮膚組織HIF-1α也明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性組和低劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量顯著降低（P＜0.01）；高、中劑量組大鼠皮膚組織Beclin1蛋白含量降低（P＜0.05）；各劑量組及陽性組大鼠皮膚組織LC3-Ⅱ蛋白含量均不同程度降低（P＜0.05）。見表1及圖4。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的活性表達。

圖4 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚組織HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達的影響（免疫組化，400×）Fig 4 Effect of aqueous extract of Tung flower on HIF-1α，Beclin1，LC3-Ⅱ expression in the skin tissue of scalded rats（immunohistochemistry，400×）

表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

表1 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表達的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

組別 HIF-1α Beclin1 LC3-Ⅱ正常組 0.2019±0.0042 0.2146±0.0061 0.2110±0.0062模型組 0.2240±0.0119**0.2401±0.0141**0.2355±0.0067**陽性組 0.2025±0.0046##0.2122±0.0063##0.2170±0.0147#高劑量組 0.2037±0.0014# 0.2176±0.0031# 0.2190±0.0025#中劑量組 0.2044±0.0080# 0.2207±0.0095# 0.2179±0.0062#低劑量組 0.2189±0.0124 0.2157±0.0111##0.2201±0.0037#

3.4 對大鼠血清HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響

由表2可知，與正常組比較，模型組血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組與油桐花水提物高、中劑量組大鼠血清中HIF-1α濃度明顯降低（P＜0.05）；陽性組，油桐花水提物各劑量組血清中Beclin1濃度降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性組，油桐花水提物高、中劑量組的大鼠血清中LC3-Ⅱ 濃度降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能抑制燙傷大鼠血清HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ的表達。

表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

表2 油桐花水提物對燙傷大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ濃度的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

組別 HIF-1α/（pg·mL－1）LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常組 51.326±1.875 9.191±0.646 742.507±58.647模型組 56.070±2.570** 11.338±0.645** 876.069±60.161**陽性組 52.286±3.670# 9.677±0.565## 760.148±52.932##高劑量組 51.980±3.189# 9.990±1.144# 764.556±63.867##中劑量組 52.403±2.469# 10.128±1.087# 779.019±65.049#低劑量組 54.560±2.238 9.966±0.875# 838.497±58.231 Beclin1/（ng·mL－1）

3.5 皮膚組織蛋白質印跡法檢測HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表達情況

模型組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達均顯著高于正常組（P＜0.01）。給藥21 d后，與模型組相比，各組大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能降低燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的蛋白表達，見表3及圖5。

圖5 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響Fig 5 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat

表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

表3 油桐花水提物對燙傷大鼠皮膚中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

注（Note）：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常組 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000模型組 1.6349±0.0949**1.8725±0.3075**2.2788±0.5448**陽性組 1.1659±0.0385##1.3667±0.1973##1.5265±0.2533#高劑量組 1.2659±0.0790##1.1412±0.0631##1.4509±0.4272#中劑量組 1.3620±0.1447##1.3718±0.1261##1.6267±0.2611#低劑量組 1.4574±0.0862# 1.4910±0.0923# 1.6499±0.2459#組別 HIF-1α/（pg·mL－1）Beclin1/（ng·mL－1）

4 討論

本課題組前期已掌握了油桐花水提物制備方法，發現其水提物的效果最優。燒燙傷是由外部熱力致皮膚組織損傷，進而缺血缺氧，變性壞死的疾病[11]，組織細胞缺氧與自噬是其損傷的兩大靶點。本研究通過油桐花水提物外用直接干預其信號通路上的關鍵蛋白治療燙傷。

組織缺氧程度常用HIF-1α表達水平表示，檢測自噬活性常選用Beclin1、LC3-Ⅱ 作為目標蛋白。研究表明，下調HIF-1α可抑制Beclin1、LC3-Ⅱ 表達[12]，實驗及臨床中常通過調控這3種因子表達來達到治療目的[12]。用藥干預后HE染色結果證明，油桐花水提物可促進燙傷皮膚組織損傷修復。從創面恢復圖片、創面大小、HE染色結果看，油桐花水提物治療燙傷療效是肯定的。免疫組化、ELISA、Western blot等檢測結果提示油桐花水提物可通過調控缺氧與自噬信號通路治療燙傷。

綜上，大鼠皮膚燙傷會導致皮膚組織細胞缺氧[13]，自噬增強。油桐花水提物可抑制HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信號通路開放，緩解燙傷大鼠皮膚組織缺氧，抑制細胞過度自噬而帶來的損傷，恢復燙傷創面，與陽性藥物濕潤燒傷膏的作用相似。本實驗為后續研究油桐花水提物其他作用機制與臨床開發應用奠定了一定基礎。